呂煜夢 徐小萍 張舒婷 郭志鵬 王錦鋒 林玉玲 王天池 賴鐘雄

摘 ?要 ?通過優(yōu)化消毒和不定芽誘導條件等，建立了三明野生黃精根狀莖的組培體系。結果表明：將野生黃精外植體依次在清水下用軟毛刷刷洗去野生黃精根狀莖表面的泥土，在加洗衣粉的自來水中沖洗16?h，在3%多菌靈浸泡2?d（期間時常振蕩搖晃），用清水洗去表面殘留的多菌靈后置于濾紙上晾放5?h，再用75%酒精處理30?s，加0.2%氯化汞浸泡15?min消毒處理之后，野生黃精外植體的污染率低至20.2%。春季3—4月的野生黃精外植體的不定芽萌發(fā)能力和長勢均明顯優(yōu)于11—12月。三明野生黃精的最佳不定芽誘導培養(yǎng)基為：MS+6-BA?4.0?mg/L?+NAA?0.2?mg/L，在其上培養(yǎng)時誘導出芽率高達88.0%。

關鍵詞 ?野生多花黃精;無菌體系;組織培養(yǎng);不定芽誘導

中圖分類號 ?S961.6 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?An aseptic tissue culture procedure was established for wild Polygonatum cyrtonema Hua in Samming by optimizing the disinfection and the adventitious bud induction procedures， in which the tubers from wild-growing plants were used as the explants. The best sterilization procedure for the explants was as follows： brushed soils off the tubers in clear water with a soft toothbrush; cleaned within diluted detergent for 16 hours; soaked in 3% carbendazim for 2 days （shaked intermittently） and washed in water to remove the residual carbendazim from the surface; dried on filter paper for 5 h; dipped first in 75% alcohol for 30 s and then in 0.2% mercuric chloride for 15 min， which resulted in a contamination rate of only 20.2%. Comparatively， the explants from March to April were significantly better than those from November to December in both the growth and the induction of adventitious buds. The optimal medium for the adventitious bud induction of the wild P. cyrtonema Hua explants was： MS+6-BA 4.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L， and the budding rate on the medium was as high as 88.0%.

Keywords ?wild Polygonatum cyrtonema Hua; sterile system; tissue culture; adventitious bud induction

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.015

三明野生黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum Mill.）多年生藥用草本植物，集藥用、食用、美容和觀賞價值于一身，具有廣闊的開發(fā)利用前景[1]。黃精根狀莖主要含多糖[2]、黃酮、蒽醌、甾體皂苷[3]、木脂素等化合物及多種對人體有用的氨基酸等多種物質，性平、味甘，為滋補上品，具有滋陰潤燥、降血脂、降血糖、降血壓、提高人體免疫力、補中益氣、平補氣血的作用和功效[4-8]。但由于黃精生長周期長，種子繁殖需要5 a以上，根狀莖繁殖也至少需要3 a，傳統(tǒng)的無性繁育技術不僅使黃精優(yōu)良性狀難以保存，而且繁殖效率較低，極大地限制了黃精的規(guī)模化擴繁。近年來隨著人們對黃精的需求量與日俱增，野生資源已遠遠不能滿足生產的需要，工廠化生產勢在必行[9]。植物組織培養(yǎng)技術不僅可以很好地保存黃精的優(yōu)良性狀，而且還可以消除季節(jié)等外在因素的影響，從而在可控的環(huán)境下顯著提高增殖系數(shù)。因此，建立高效的無菌培養(yǎng)體系是目前黃精快速繁殖的重要途徑。

目前，關于黃精的組培快繁的研究已有不少報道[10-13]，劉紅美等[14]對黃精無菌體系的建立到種苗進行了系統(tǒng)研究;徐忠傳等[15]就殺菌劑對黃精根狀莖的影響進行了研究，徐忠傳等[16]、徐紅梅等[17]先后研究了黃精的離體快繁體系，并建立了從外植體選擇、愈傷組織誘導、不定芽的誘導、生根壯苗培養(yǎng)到煉苗移栽的較為完整的黃精離體再生體系。目前，對于三明野生黃精的離體組織培養(yǎng)還未有詳細的研究，所以本文從外植體預處理、外植體消毒、啟動培養(yǎng)及不定芽的誘導等方面對三明野生黃精的離體培養(yǎng)體系的建立進行了初步研究，以期為我國野生黃精離體培養(yǎng)及工廠化生產提供參考與借鑒。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

取三明地區(qū)野生黃精根狀莖為外植體，選表面淺黃色至黃褐色、生活力較強的地下根狀莖為外植體。消毒試劑為多菌靈溶液、次氯酸鈉和氯化汞。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外植體預處理 ?取放晴3 d以上春季3—4月的三明野生黃精，野生黃精根狀莖去除須根，選色澤鮮黃，生活力較強的地下根狀莖為外植體。采用表1中的3種方法進行外植體預處理。

1 野生黃精根狀莖去除須根，用軟毛牙刷在清水下洗去野生黃精根狀莖表面的泥土，再采用3%多菌靈浸泡3 d，期間時常震蕩搖晃，在清水下用軟毛牙刷清洗根狀莖表面殘留的多菌靈，盛放于瓷杯中，獲得正式消毒前的外植體。

2 將根狀莖用軟毛牙刷在清水下洗去野生黃精根狀莖表面的泥土后，不加多菌靈表面預消毒，晾干3 d，獲得消毒前外植體備用。

3 將根狀莖用軟毛牙刷在清水下洗去野生黃精根狀莖表面的泥土，先用洗衣粉在自來水下開到最大，沖洗16 h，再用3%多菌靈浸泡2 d，期間時常震蕩搖晃，在清水下用軟毛牙刷清洗根狀莖表面殘留的多菌靈，在濾紙上晾放5 h后進行外植體消毒。

1.2.2 ?外植體消毒 ?選擇1.2.1中最佳外植體預處理方法處理野生黃精根狀莖后，分別使用以下2種方法對外植體進行消毒：（1）先用酒精（75%）消毒30 s，再使用氯化汞（0.2%）浸泡消毒（10、15、20 min），消毒后的野生黃精根狀莖用無菌水沖洗3～4次;（2）先用酒精（75%）消毒30 s、再使用次氯酸鈉（2%）浸泡消毒（20、30、40 min），消毒后再用無菌水沖洗3～4次。每個處理3組，每組20瓶，每瓶接1個外植體，接種后15 d統(tǒng)計外植體污染率、褐化率和出芽率。

將預消毒處理后獲得的野生黃精外植體分裝于瓷杯中，置于經紫外消毒的超凈工作臺上，先用無菌水清洗3次，根據(jù)根狀莖節(jié)間大小切成小塊;再使用75%酒精浸泡30?s;然后使用0.2% HgCl2浸泡15 min，同時滴一滴吐溫20;最后使用無菌水清洗4～5遍至干凈;將消毒好的根狀莖置于濾紙上，晾干;接種于MS培養(yǎng)基（MS+6-BA 4 mg/L +NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH 5.8），每個處理3組，每組20瓶。

1.2.3 ?培養(yǎng)條件 ?外植體消毒后接種于經高壓（121?℃/20 min）滅菌的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，12 h/d光照培養(yǎng)，光照強度為22～ 25 μmol/（m2s），培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計污染率、褐化率及成活率。

1.2.4 ?取材時間對野生黃精不定芽誘導的影響 ?分別在3—4月和11—12月對三明野生黃精進行取材，接種于表2中的2號培養(yǎng)基中，比較不同季節(jié)取材對外植體不定芽誘導的影響，每瓶接入一個外植體，每個處理3組，每組20瓶，15?d后統(tǒng)計污染率和出芽率。

1.2.5 ?三明野生黃精不定芽誘導 ?三明野生黃精不定芽誘導培養(yǎng)基為：采用1.2.1和1.2.2中對比實驗后的最佳處理組合篩選出來的無污染健康的外植體接入到MS+NAA 0.2?mg/L+30?g/L蔗糖+7?g/L瓊脂的固體培養(yǎng)基（pH為5.8），同時添加不同濃度（2.0、4.0、6.0、10.0 mg/L）的6-BA（6-芐氨基嘌呤）（表2），接種15?d后觀察根狀莖的存活情況與出芽情況。每瓶接種1塊根狀莖，每個處理3組，每組20瓶。

1.3 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、圖表制作及相關分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?外植體預處理對無菌體系建立的影響

由表3可知，外植體污染率的大小為2>1>3，污染率分別為89.1%、53.8%、34.6%。由實驗結果可知，未經多菌靈溶液浸泡的外植體（處理2）的污染率高達89.1%，說明多菌靈溶液對于野生黃精外植體的消毒效果有明顯影響，加入多菌靈溶液浸泡后的外植體污染率遠遠低于未加多菌靈浸泡的。此外，外植體的污染率與洗衣粉水沖洗植株的時間也有關聯(lián)，未經過洗衣粉水沖洗而直接浸泡在多菌靈中的外植體的污染率比經過洗衣粉水的沖洗后再浸泡于多菌靈溶液中高出19.2%，這可能是因為野生黃精根狀莖生長于泥土中，表面帶有大量微生物，將其置于洗衣粉水下沖洗一定的時長，洗衣粉水也具有一定的殺菌能力，再采用一定濃度的酒精和氯化汞消毒外植體，便可以有效的降低污染率。

2.2 ?乙醇與次氯酸鈉不同時間配合處理對外植體的影響

為研究次氯酸鈉對野生黃精外植體消毒效果的影響，本實驗使用2%的次氯酸鈉對外植體進行消毒。實驗結果表明，2%次氯酸鈉處理不同時間后，野生黃精外植體均大量污染，污染率高達89.7%，褐化率高達47.1%（表4）。且大部分為細菌污染，有部分塊莖甚至腐爛。因此，采用2%次氯酸鈉消毒的方法顯然不適合于野生黃精外植體的消毒滅菌，不利于野生黃精無菌體系的建立。

2.3 ?乙醇與氯化汞不同時間配合處理對外植體的影響

由表5可知，乙醇與氯化汞結合進行消毒對外植體污染有一定的控制作用，野生黃精的根狀莖的污染率隨著消毒液浸泡時間的增加而降低，且消毒滅菌時間為15 min時污染率與褐死率之和最低，成活率最高。但使用氯化汞消毒液浸泡時間為20、25 min時，其污染率繼續(xù)下降，但褐化率均明顯升高，推測長時間的氯化汞消毒處理在殺死微生物的同時對外植體也產生了毒害作用。因此，采用處理1的75%乙醇30 s+0.2%氯化汞處

2.4 ?不同取材時間對不定芽誘導的影響

對不同季節(jié)的三明野生黃精根狀莖進行取材，接入表2中的2號培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計污染率和出芽率。由表6可以看出在3—4月份春季取材的外植體接種后污染率較低，且出芽率高達65.8%，而在冬季11—12月取得的外植體出芽率約等于0%，推測不同時間采集的外植體因其生理狀態(tài)和內源激素含量存在差異， 導致其萌發(fā)效率存在差異。根據(jù)周新華等[18]的研究結果，3—4月取材的外植體其腋芽的萌發(fā)能力和長勢均明顯優(yōu)于其他時間段。

2.5 ?不同培養(yǎng)基對不定芽誘導的影響

將滅菌消毒好的外植體，分別接種于表2的四種培養(yǎng)基內，培養(yǎng)15 d。由表7可知，不同6-BA濃度對野生黃精外植體不定芽的誘導影響顯著，其污染率為1>4>3>2，存活率為2>3>1>4，出芽率為2>1>3>4，即2號培養(yǎng)基的污染率最低，且存活率和出芽率最高，說明6-BA濃度為4.0 mg/L（2號培養(yǎng)基）是誘導野生黃精不定芽的最佳濃度，此時野生黃精出芽率和存活率最高（圖1）。隨著6-BA濃度升高，其出芽率反而下降，推測6-BA濃度過高可能會抑制不定芽的生長。

3 ?討論

3.1 ?外植體預處理及消毒方法的篩選有利于三明野生黃精無菌體系建立

野生黃精根狀莖長期生長于泥土當中，根莖表面通常附著很多微生物，因此對于野生黃精根狀莖的徹底消毒是野生黃精無菌體系建立至關重要的一步。目前還未有文獻探討過關于野生黃精根狀莖作為外植體預處理的消毒方法對外植體消毒情況的影響，所以本研究采用3種不同方法對三明野生黃精根狀莖進行外植體的預處理消毒，發(fā)現(xiàn)野生黃精根狀莖離開土壤后，用軟毛牙刷在清水下洗去野生黃精根狀莖表面的泥土，在加洗衣粉的自來水中沖洗16?h，再用3%多菌靈浸泡2 d，是外植體預處理的最佳方法，外植體污染率僅為34.6%。外植體在消毒劑（0.2%氯化汞或者2.0%次氯酸鈉溶液）中浸泡時間的長短對野生黃精的根狀莖的褐化率、污染率呈一定的規(guī)律性：三明野生黃精根狀莖的的褐化率隨著消毒劑浸泡時間的增加而増加，而污染率隨著消毒劑浸泡時間的増加而降低。

徐忠傳等[16]、鮑錦庫[19]研究了多花黃精根狀莖的滅菌方法，但未說明滅菌效果，劉紅美等[14]采用了75%的酒精充分擦洗根莖表面，再使用2.5%次氯酸鈉滅菌3次、每次5?min的多次短時滅菌法消毒效果較好，但并未說明消毒滅菌后的污染率等具體的情況。周新華等[10]采用了75%的酒精表面滅菌30?s，再用0.1%的氯化汞深層滅菌10?min，滅菌效果較好，外植體材料無菌保存率可達73.2%。戚華沙等[20]對藍藥睡蓮的根狀莖以不同濃度的次氯酸鈉和氯化汞配合使用對其進行滅菌消毒，結果表明0.1% HgCl2 20 min+5.0% NaClO 5?min是藍藥睡蓮根狀莖較適宜的消毒方法。寧慧等[21]對與黃精同屬百合科的玉竹的外植體進行了相似的外植體預處理及消毒（75%乙醇消毒15～20 s+0.2%氯化汞消毒9～11 min），發(fā)現(xiàn)乙醇和氯化汞配合使用對于地下根莖的消毒效果較好。本實驗通過使用0.2%氯化汞對野生黃精外植體進行不同時間的消毒滅菌后，結果表明，選擇75%酒精處理30 s，0.2%氯化汞溶液消毒15?min是野生黃精最合適的消毒方式。

本研究使用2%次氯酸鈉對野生黃精外植體進行不同時間的消毒滅菌后，結果發(fā)現(xiàn)2%的次氯酸鈉對野生黃精的外植體消毒效果不是很明顯，與劉紅美等[14]對多花黃精所消毒后的結果相差較大，推測可能是由于品種的差異或者取材時間不同引起的消毒效果的差異。此外，本研究采用相同濃度的氯化汞對野生黃精外植體進行處理，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長，外植體的污染率不斷下降，但褐化程度越來越嚴重，且氯化汞處理25?min污染率最低，褐化率卻最高，推測氯化汞在滅殺微生物的同時對野生黃精外植體也產生一定的毒害，氯化汞處理的時間越長對外植體損傷越嚴重，無菌外植體就越脆弱。因此，本研究認為75%酒精處理30 s，0.2%氯化汞浸泡15 min處理外植體是比較適宜的，其外植體的存活率和出芽率均較高。用次氯酸鈉消毒滅菌處理比氯化汞處理的污染率和褐化率明顯高很多，說明利用氯化汞消毒滅菌的方法更適宜。而通過提高次氯酸鈉的濃度對野生黃精外植體進行消毒滅菌，是否能提高其消毒效果，有待進一步研究。

3.2 ?一定濃度的6-BA能促進三明野生黃精不定芽的誘導

植物組織離體培養(yǎng)過程中，外植體不定芽的誘導不僅僅和植物生長調節(jié)劑的種類和濃度有關，還和植物品種、外植體生長環(huán)境、取材時間等因素的不同有關。在黃精組織離體培養(yǎng)過程中，細胞分裂素和生長素對不定芽的誘導起著至關重要作用，而6-BA具有高效、穩(wěn)定、廉價和易于使用等特點，因此被廣泛采用，是植物組織培養(yǎng)中最常見的細胞分裂素[22]。6-BA能誘導不定芽的產生，促進側芽生長，促進細胞分裂，大多數(shù)材料都可以在細胞分裂素和生長素配合使用的情況下誘導形成不定芽。此外，研究表明不同植物生長調節(jié)劑組合誘導多花黃精的效果不同[23-25]，本研究采用MS培養(yǎng)基，通過添加固定濃度的NAA濃度，同時單一改變6-BA濃度來研究誘導野生黃精不定芽的產生，發(fā)現(xiàn)當6-BA濃度為2.0～ 10.0?mg/L時均能誘導出不定芽。而前人還采用其他種類的激素來對黃精的不定芽進行誘導，如李鶯等[26]從黃精的愈傷組織中也能誘導出不定芽，且在培養(yǎng)基MS +6-BA 3.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L中誘導率最高;劉紅美等[14]在MS培養(yǎng)基中添加0.2?mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA誘導出不定芽，且與本研究6-BA的濃度相同;牟小翎等[27]對泰山野生黃精進行了不定芽的誘導，結果為MS+6-BA 4.0 mg/L，說明6-BA濃度為4.0 mg/L是較適宜黃精誘導出不定芽的，且單一使用細胞分裂素也可能誘導出不定芽，這可能與植物體本身含有的內源激素有關;李鶯等[28]誘導雞頭黃精叢生芽激素組合是MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 0.5mg/L，增殖倍數(shù)達2.40;孫俊威等[29]在MS培養(yǎng)基中添加ZT 1.0?mg/L+NAA 0.2 mg/L誘多花黃精根狀莖不定芽效果最好，誘導率為87.9%。此外，徐忠傳等[16]都是使用了MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L誘導出黃精的不定芽，這與本研究的結果一致。

后續(xù)我們還將深入進行野生黃精不定芽增殖、生根壯苗最適培養(yǎng)基篩選等研究，以完善野生黃精不定芽再生途徑組織離體培養(yǎng)體系。

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