張桂云，楊偉強，林振宇

(1.漳州職業(yè)技術學院食品工程學院，農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高等學校應用技術工程中心，福建漳州 363000;

2.閩南師范大學化學化工與環(huán)境學院，福建漳州 363000;3.福州大學化學學院，福建福州 350108)

0 引言

在水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中，為了治療和預防各種病害、提高產(chǎn)量效益，存在誤用、濫用各種藥物的情況，主要包括三苯甲烷類染料、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類、硝基呋喃類獸藥等.這些殘留在水產(chǎn)品中的藥物經(jīng)食用后在人體中蓄積，可能會產(chǎn)生致畸、致癌的嚴重危害［1－2］.因此，國家的相關法律法規(guī)對水產(chǎn)品中的獸藥殘留限量做了嚴格的規(guī)定［3］.目前在國家標準中，獸藥殘留的檢測方法以分類檢測為主［4－9］.對于同一個樣品的多項獸殘檢測指標，需要進行多次的樣品前處理和上機測試，檢測周期長、效率低、成本高，遠不能滿足快速發(fā)展的檢測需要.發(fā)展和建立準確、高效、經(jīng)濟的獸藥多殘留檢測技術成為當前業(yè)界研究的焦點［10］.

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)結(jié)合了超高效液相色譜的高選擇性、高靈敏度響應性特點;能夠?qū)崿F(xiàn)多目標物在短時間內(nèi)的快速分離和檢測，是多獸藥殘留檢測的首選方法［11－14］.然而由于各種獸藥的理化性質(zhì)具有差異性，傳統(tǒng)的固相萃取柱凈化方法無法實現(xiàn)樣品一次處理、同時檢測多參數(shù)的模式，嚴重制約了UPLC－MS/MS的優(yōu)勢.分散固相萃取(DSPE)技術是一種快速發(fā)展的樣品前處理方法，通過在試樣提取液中直接加入N－丙基乙二胺固相吸附劑(primary secondary amine sorbent，PSA)、石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)、C18、中性氧化鋁等固體吸附劑，去除大部分非目標化合物從而達到凈化的效果，具有操作簡便、成本經(jīng)濟的優(yōu)點［15－16］.將DSPE方法與UPLC－MS/MS技術相結(jié)合，能夠解決樣品分類處理的問題，同時彌補凈化不完全的不足，是多目標物檢測的有效解決途徑［17］.

本研究針對水產(chǎn)品中幾類常需監(jiān)測的獸藥(包括三苯甲烷類染料、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類獸藥)，結(jié)合質(zhì)檢部門的檢測需求，建立一種分散固相萃取聯(lián)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中多種獸藥殘留的檢測方法.具有操作簡便、快速高效、結(jié)果準確、成本經(jīng)濟的特點，為監(jiān)管部門的日常檢測提供了有力的技術支撐.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290－6460超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);T10均質(zhì)機(德國IKA公司);EOFO－945066數(shù)顯型多管式旋渦振蕩器(美國Talboys公司);TG16－WS高速冷凍離心機(中國湘儀公司);DN－24A氮吹儀(上海比朗儀器公司).

孔雀石綠、孔雀石綠－D5、隱形孔雀石綠、隱形孔雀石綠－D6、氯霉素、氯霉素－D5、土霉素、金霉素、四環(huán)素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準物質(zhì)(純度:94.0%～99.7%)均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈均為德國Merck公司的色譜純試劑;PSA粉、C18粉、無水硫酸鎂購自安譜公司;其它試劑均為分析純;實驗用水為英國ELGA公司超純水系統(tǒng)制備的超純水.

1.2 標準溶液的配置

根據(jù)上述各標準物質(zhì)的純度，分別準確稱取適量的獸藥標準品并用甲醇溶解，配制成1.0 mg·mL－1的標準儲備液，于－18℃避光保存.實驗前，準確移取適量的各種獸藥標準儲備液用甲醇稀釋，使混合標準溶液中各標準品的質(zhì)量濃度分別為: 孔雀石綠 5.0 μg·mL－1、隱形孔雀石綠 5.0 μg·mL－1、氯霉素 1.0 μg·mL－1、土霉素 20.0 μg·mL－1、金霉素 20.0 μg·mL－1、四環(huán)素 20.0 μg·mL－1、磺胺嘧啶 10.0 μg·mL－1、磺胺甲嘧啶 10.0 μg·mL－1、磺胺二甲嘧啶 10.0 μg·mL－1、恩諾沙星 10.0 μg·mL－1、環(huán)丙沙星 10.0 μg·mL－1.混合內(nèi)標溶液的質(zhì)量濃度分別為: 孔雀石綠－D5 為 1.0 μg·mL－1、隱形孔雀石綠－D6 為1.0 μg·mL－1、氯霉素－D5 為 1.0 μg·mL－1，于 4 ℃保存.最后，用空白樣品提取液稀釋該混合標準溶液并添加混合內(nèi)標溶液，配制成不同濃度的系列基質(zhì)標準曲線，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.3 樣品前處理

取樣品的可食部分，經(jīng)高速組織搗碎機搗碎、勻漿，試樣于凍庫保存.準確稱取約5.0 g勻漿后的樣品于50 mL塑料離心管中，加入混合內(nèi)標溶液、3.0 mL甲酸水溶液(1%(體積分數(shù))，含EDTA 100 mmol·L－1)和10.0 mL乙腈、萃取鹽包(4.0 g硫酸鈉和1.0 g氯化鈉)和陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩5 min.靜置10 min后，以10 000 r·min－1高速離心5 min.于15 mL塑料離心管中加入200 mg PSA粉末、50 mg C18粉末、500 mg無水硫酸鎂，以2 mL超純水渦旋10 s活化;立即加入5.0 mL乙腈提取上清液并渦旋振蕩2 min，以10 000 r·min－1高速離心5 min.取上清液氮吹，用流動相定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 mm的微孔濾膜過濾，上機測試.

1.4 儀器工作條件

色譜條件:Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 mm).流動相A為乙腈，流動相B為乙酸銨水溶液(10 mmol·L－1).梯度洗脫程序(以 A 的體積分數(shù)表示):0～1.0 min 時，A 為 10%;1.0～4.0 min時，A由10%升至 15%;7.0 min時升至 90%;7.0～8.0 min時，A 為 90%;隨后降至 10%.流速為 0.25 mL·min－1，進樣量為 5 mL.

質(zhì)譜條件:電噴霧正/負離子模式電離(ESI+/ESI－).電噴霧電壓4 000 V;干燥氣溫度300℃，流量5 L·min－1;霧化氣壓力0.35 MPa;鞘氣溫度250℃，流量11 L·min－1;多反應監(jiān)測模式(multi－reaction monitoring，MRM)檢測.各種農(nóng)殘檢測的質(zhì)譜參數(shù)見表1.

表1 獸藥質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 MS parameters of veterinary drugs residues

1.5 方法的回收率和精密度實驗

采用經(jīng)測試不含待測獸藥的陰性樣品，向其中添加3個質(zhì)量濃度水平的混合標準溶液，按照本研究所述的方法進行回收率和精密度的測試實驗.其中，每個加標水平做6個平行測試樣，并計算回收率及相對標準偏差(RSD).

2 結(jié)果與討論

2.1 分散固相萃取凈化條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

綜合分析本實驗中幾類獸藥的理化性質(zhì)，確定偏極性的乙腈為提取溶劑.乙腈不僅可避免過多脂肪的提取，同時又可沉淀蛋白，因而適用于水產(chǎn)品中大多數(shù)偏極性獸藥的提?。?6］.此外，磺胺類、喹諾酮類獸藥可呈酸堿兩性，在酸性條件下更容易被萃取，因此添加一定的甲酸.而四環(huán)素類獸藥易與同樣液中的金屬離子螯合，因此需要添加一定濃度的EDTA以屏蔽該作用［18］.在樣品提取的過程中，加入適量的無水硫酸鈉和氯化鈉可有效防止樣品中水分及水溶性雜質(zhì)進入提取液中，達到脫水和鹽析的效果，也有助于增強提取的效果［13］.

2.1.2 PSA、C18、無水硫酸鎂用量的優(yōu)化

PSA能夠除去提取液中的脂肪酸、碳水化合物和色素;C18則對脂肪的去除效果明顯;無水硫酸鎂做為脫水劑具有強大的吸水能力，同時其與水結(jié)合后放出熱量也有利于目標物的提取［15］.水產(chǎn)品的基質(zhì)中主要含有脂肪、蛋白、碳水化合物以及色素等雜質(zhì)，采用PSA、C18與無水硫酸鎂的組合凈化劑可有效地去除大部分干擾基質(zhì)的影響.但各凈化劑的用量和配比仍需進一步優(yōu)化和考察，其對實驗結(jié)果的影響如圖1所示.

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜分離條件的選擇

實驗以乙腈和弱酸性乙酸銨水溶液為流動相，采用Waters BEH C18色譜柱為分離柱，通過優(yōu)化合適的梯度洗脫程序，基本實現(xiàn)本項目中多種獸藥的有效分離，有利于后續(xù)的質(zhì)譜測定.其總離子流圖如圖2所示(測試溶液為節(jié)1.2中所配制的標準混合液稀釋100倍).

圖1 PSA和C18的用量對各獸藥殘留回收率的影響Fig.1 Effect of PSA and C18 on recovery of veterinary drugs residues

圖2 獸藥總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of veterinary drugs residues

2.2.2 質(zhì)譜檢測參數(shù)的優(yōu)化

實驗首先以單個獸藥標準品為分析物，逐個確定其檢測離子對，并優(yōu)化裂解電壓、碰撞能等質(zhì)譜檢測參數(shù)(見表1).其中，氯霉素為負離子電離模式且濃度水平較低，因此對其施加600 V的EMR電壓以提高質(zhì)譜響應.其余獸藥均為正離子電離模式，同樣對濃度較低的孔雀石綠和隱形孔雀石綠施加200 V的EMR電壓以提高質(zhì)譜響應.根據(jù)表1所優(yōu)化的質(zhì)譜條件及色譜條件，選擇多反應監(jiān)測模式(MRM)進行檢測，11種藥物能在8 min內(nèi)分離，目標物的MRM圖如圖3所示.

圖3 獸藥的MRM圖Fig.3 MRM of veterinary drugs residues

2.3 方法的線性范圍及檢出限

基質(zhì)效應是影響液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對目標物定量的重要因素，研究通過在陰性樣品提取液中添加不同濃度的混標配制基質(zhì)標準曲線，來消除基質(zhì)效應的影響，準確定量待測樣品.實驗結(jié)果表明，幾種獸藥的質(zhì)譜響應強度(y)與其質(zhì)量濃度(x，ng·mL－1)在一定的范圍內(nèi)具有良好的線性關系(見表2)，相關系數(shù)均大于0.99.為避免假陽性、確保結(jié)果的準確性，選取10倍信噪比處的信號值來計算該方法的檢出限.與國標方法檢出限［4－8］相比，本方法的靈敏度均優(yōu)于國標方法.

表2 方法的線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits for this method

2.4 方法的回收率和精密度

通過加標回收實驗來評價方法的準確度和精密度.取魚、蝦、牡蠣等陰性樣品，添加3個水平的混合標準溶液，并按照本文所述條件進行測試，其中每個加標水平平行實驗6次，結(jié)果列于表3.表3的檢測結(jié)果顯示，該方法的回收率為81.6%～96.6%，相對標準偏差不超過9.2%.作為一種多目標物的檢測方法，該方法在簡化前處理的情況下具有較高的準確度和重現(xiàn)性，能夠滿足日常檢測的要求.

表3 方法的回收率和精密度(n=6)Tab.3 Results of tests for recovery and precision(n=6)

續(xù)表3Continue table 3

2.5 實際樣品測試

將所建立的方法應用于質(zhì)檢部門的監(jiān)督抽查檢測任務中.在農(nóng)貿(mào)市場中隨機抽檢100份樣品，包括魚、蝦、貝等類型水產(chǎn)品.檢測結(jié)果表明，國標規(guī)定不得檢出的氯霉素在貝殼類水產(chǎn)品中的檢出率較高，23份貝殼類樣品中檢出11份，檢測結(jié)果在0.5～2.0 μg·kg－1.此外，一些魚類中也檢出土霉素、金霉素等四環(huán)素類殘留，檢測結(jié)果在 12.0～43.0 μg·kg－1，但均小于國標規(guī)定的檢出限(50.0 μg·kg－1)［6］.其他項目均未見檢出.

3 結(jié)語

本研究聯(lián)合分散固相萃取技術和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，發(fā)展了一種水產(chǎn)品中多種獸藥殘留的檢測方法.通過優(yōu)化分散固相萃取的實驗條件，建立了水產(chǎn)品中多種類獸藥殘留的一次性樣品前處理方法.同時采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測手段，在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)了多獸殘目標物的高靈敏度、高通量檢測.通過方法學考察和加標回收實驗，表明經(jīng)本方法測試的各項獸殘檢出限均低于現(xiàn)有國家標準，同時具有良好的回收率和精密度.將其應用于日常檢測中，具有操作簡便、快速高效、結(jié)果準確、成本經(jīng)濟的特點，為水產(chǎn)品中的多獸殘檢測提供了有效的解決途徑.