高晶晶 慕 苗 閆君芝 劉麗娜

(榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000)

原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素結(jié)合而成的聚合體[1]，具有較強(qiáng)的抗氧化及清除自由基能力[2]，在預(yù)防和治療心血管疾病、抗衰老、抗過敏、抗癌、抑菌等方面有顯著作用[3-6]。小粒黑豆是中國陜北地區(qū)種植的一種高產(chǎn)量黑豆品種，在黑豆產(chǎn)品加工過程中，豆皮大部分被去掉，豆皮的營養(yǎng)價(jià)值及其有效成分未被充分利用[7-8]。研究[9-11]表明，豆皮含有大量營養(yǎng)保健物質(zhì)，尤其是黑紫色種皮含有大量的抗氧化性物質(zhì)原花青素。目前，對(duì)黑豆皮的研究[12]主要集中在膳食纖維、色素、黃酮等方面，對(duì)黑豆皮原花青素的研究[13]鮮見報(bào)道，尤其是對(duì)其抗氧化性研究[14]則更少。

目前原花青素常用的提取方法有乙醇溶液提取法、超臨界提取法及雙水相萃取法等[15-16]。本研究擬采用乙醇溶液提取法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到黑豆皮原花青素的最佳提取工藝，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究，以期為原花青素的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料和試劑

陜北小粒黑豆皮：陜西神木產(chǎn)；

無水乙醇：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、H2O2：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

濃鹽酸：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；

鄰苯三酚、FeSO4、水楊酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

香草醛、VC(抗壞血酸)、DPPH：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：FA-1004型，上海精科天平廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴：HH-501型，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；

分光光度計(jì)：UV-2450型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確配制濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白液為蒸餾水，取空白和各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液1 mL于6支試管中，分別加入5 mL 2%香草醛—甲醇溶液，最后各加入1 mL濃鹽酸震蕩搖勻，于500 nm測(cè)其吸光度值[17-18]，以兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液的濃度及吸光度值為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=1.089x+0.013 4，R2=0.998 4。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 黑豆皮原花青素含量的檢測(cè) 采用香草醛—鹽酸法。準(zhǔn)確吸取原花青素提取液1 mL，稀釋一定倍數(shù)，后續(xù)操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備相同。黑豆皮原花青素提取得率按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

R——黑豆皮花青素提取得率，%；

c——提取液中原花青素濃度，mg/mL；

v——原花青素提取液體積，mL；

m——黑豆皮質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

(1) 提取液濃度對(duì)提取得率影響：準(zhǔn)確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，加入150 mL濃度分別為50%，55%，60%，65%，70%的乙醇溶液，45 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，提取3.5 h，過濾，500 r/min離心10 min，測(cè)定上清液吸光度值，計(jì)算原花青素的提取得率。

(2) 提取時(shí)間對(duì)提取得率影響：準(zhǔn)確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，加入150 mL 60%乙醇溶液，45 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，分別提取3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h，后續(xù)方法同1.2.3(1)。

(3) 提取溫度對(duì)提取得率影響：準(zhǔn)確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，加入150 mL 60%乙醇溶液，分別于40，45，50，55，60 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，提取4 h，后續(xù)方法同1.2.3(1)。

(4) 液料比對(duì)提取得率影響：準(zhǔn)確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，分別加入100，150，200，250，300 mL 60%乙醇溶液，50 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，提取4 h，后續(xù)方法同1.2.3(1)。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取溫度、液料比為試驗(yàn)因素，以提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化原花青素提取工藝條件[19]。

1.2.5 黑豆皮中原花青素的抗氧化性測(cè)定

(1) DPPH自由基清除率：準(zhǔn)確稱取一定量的DPPH溶解于無水乙醇配制成濃度為0.2 mmol/L的溶液，放置于棕色瓶中保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。取黑豆皮原花青素配制成濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL的溶液，取各濃度待測(cè)液2 mL分別加入2 mL DPPH乙醇溶液，搖勻，室溫避光下靜置30 min，517 nm下測(cè)定其吸光度值[20]。同時(shí)還需空白對(duì)照及同條件下Vc的DPPH自由基清除率的測(cè)定。DPPH自由基清除率按式(2)計(jì)算。

(2)

式中：

X——DPPH自由基清除率，%；

A0——原花青素液和DPPH混合液的吸光度值；

A1——原花青素液和空白溶劑(無水乙醇)混合液的吸光度值；

A2——DPPH溶液和空白溶劑混合液的吸光度值。

(2) 羥基自由基清除率：取5支試管分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液和2 mL水楊酸溶液，搖勻后，分別加入2 mL濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的黑豆皮原花青素溶液，最后加入2 mL 0.3% H2O2溶液， 37 ℃下反應(yīng)30 min，510 nm下測(cè)定吸光度值[21]。同時(shí)還需做空白對(duì)照及同條件下VC的羥基自由基清除率的測(cè)定。羥基自由基清除率按式(3)計(jì)算。

(3)

式中：

Y——羥基自由基清除率，%；

A0——空白液的吸光度值；

A1——原花青素液的吸光度值。

(3) 超氧陰離子清除率：取1 mL濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0. 5 mg/mL的黑豆皮原花青素溶液，依次加入pH 8.2，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液3 mL， 30 ℃水浴20 min，加入7 mmol/L鄰苯三酚3 mL混勻，反應(yīng)4 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)， 320 nm下測(cè)定吸光度值[22]。同時(shí)還需做空白對(duì)照及同條件下Vc的超氧陰離子清除率的測(cè)定。超氧陰離子清除率按式(4)計(jì)算。

(4)

式中：

Z——超氧陰離子清除率，%；

A0——原花青素液的吸光度值；

A1——以H2O代替鄰苯三酚的吸光度值；

A2——以H2O代替原花青素液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，單因素試驗(yàn)采用Origin 8.0作圖，響應(yīng)面優(yōu)化采用Design expert 10。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖2(a)可知，在乙醇濃度為60%時(shí)，原花青素的提取效果較好，其他濃度不利于原花青素的溶出。由圖2(b)得出提取時(shí)間為4 h時(shí)提取得率最高，可能是由于超過4 h后，一部分原花青素分解，提取得率反而下降。由圖2(c)可知，提取溫度為50 ℃時(shí)提取得率最高，可能是其他溫度不利于原花青素的溶出，高溫可能導(dǎo)致一部分原花青素分解。由圖2(d)得出原花青素的提取得率隨液料比的增大而升高，當(dāng)液料比超過20∶1(mL/g)時(shí)，增大溶劑用量并不能提高原花青素的提取得率。因此，選擇液料比為20∶1(mL/g)。綜上所述，在乙醇濃度60%、提取時(shí)間4 h、提取溫度50 ℃、液料比20∶1(mL/g)時(shí)，陜北小粒黑豆皮中原花青素的提取得率較高，可達(dá)5.25%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以原花青素提取得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

2.2.2 模型的建立及方差分析 由表3可知，回歸模型P<0.000 1，達(dá)到高度顯著水平，失擬誤差項(xiàng)P>0.05，不顯著，說明該模型誤差小，擬合度好；可預(yù)測(cè)黑豆皮原花青素的提取過程及提取結(jié)果。 BC、AC項(xiàng)的P值<0.000 1，說明溫度和液料比、時(shí)間和液料比的交互作用對(duì)提取得率的影響最大，為主要限制因素；從一次項(xiàng)的P值可知，液料比對(duì)提取得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時(shí)間。通過響應(yīng)面軟件的分析和計(jì)算，得回歸方程：

圖2 提取條件對(duì)黑豆皮中原花青素提取得率的影響

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)表

Y=5.32+0.099A+0.14B-0.15C-0.097AB-0.32AC-0.033BC-0.51A2-0.85B2-0.73C2。

(5)

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖3可知，提取溫度大于提取時(shí)間的影響，液料比明顯大于提取時(shí)間的影響，液料比大于提取溫度的影響，與2.2.2中P值比較得出液料比>提取溫度>提取時(shí)間一致。

由響應(yīng)面法建立的提取模型及回歸方程預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取工藝條件為提取時(shí)間4.16 h、提取溫度52.77 ℃、液料比22∶1(mL/g)，預(yù)測(cè)提取得率5.463%。為便于操作，將提取條件修正為提取時(shí)間4.2 h、提取溫度53 ℃、液料比22∶1(mL/g)，進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，得到黑豆皮原花青素平均提取得率為5.380%，與預(yù)測(cè)值5.463%基本接近，說明該提取模型預(yù)測(cè)優(yōu)化黑豆皮原花青素提取工藝是準(zhǔn)確可行的。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與提取得率

2.3 原花青素抗氧化性試驗(yàn)

2.3.1 DPPH自由基清除率 從圖4可以看出，隨著原花青素和VC濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸增加。同濃度下，VC對(duì)DPPH自由基清除率均略高于原花青素。濃度均為0.10 mg/mL時(shí)，原花青素的清除率為68.5%，而VC的清除率可達(dá)73.8%。黑豆皮原花青素的IC50值為0.075 mg/mL。結(jié)果表明：黑豆皮原花青素對(duì)DPPH自由基清除率與VC基本接近，且在一定的范圍內(nèi)其濃度與DPPH自由基清除率存在一定的量效關(guān)系。

表3 提取模型的顯著性檢驗(yàn)及分析表?

? P<0.000 1差異高度顯著；P<0.05差異顯著；P>0.05差異不顯著。

圖3 兩因子交互作用對(duì)提取率的響應(yīng)面圖

圖4 原花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.3.2 羥基自由基清除率 從圖5可以看出，隨著原花青素和VC濃度的增加，羥基自由基清除率逐漸增加，但增加速率逐漸變緩。同濃度下，VC對(duì)羥基自由基清除率略高于原花青素。濃度為1.0 mg/mL時(shí)，原花青素的清除率為68.7%，VC的清除率為74.3%。黑豆皮原花青素的IC50值為0.590 mg/mL。結(jié)果表明：黑豆皮原花青素對(duì)羥基自由基清除率與VC基本接近，有較好的羥基自由基清除能力。

圖5 原花青素對(duì)羥基自由基的清除作用

2.3.3 超氧陰離子清除率 從圖6可以看出，隨著原花青素和VC濃度的增加，超氧陰離子清除率增加。VC的清除率大于原花青素的。濃度為0.5 mg/mL時(shí)，原花青素清除率為77.6%，VC清除率為82.5%。黑豆皮原花青素的IC50值為0.220 mg/mL。

圖6 原花青素對(duì)超氧陰離子的清除作用

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)陜北小粒黑豆皮原花青素提取進(jìn)行了研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為提取時(shí)間4.2 h、提取溫度53 ℃、料液比22∶1(mL/g)、乙醇濃度60%，在此條件下陜北小粒黑豆皮原花青素平均提取得率為5.380%。黑豆皮原花青素的抗氧化性試驗(yàn)研究表明原花青素對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子均具有一定的清除效果，該抗氧化能力與原花青素濃度有一定的關(guān)系，其IC50值分別為0.075，0.590，0.220 mg/mL。通過本試驗(yàn)說明陜北小粒黑豆皮原花青素含量可觀且具有較好的抗氧化活性，后續(xù)可對(duì)黑豆皮中原花青素的抗氧化有效成分作進(jìn)一步研究。