朱新華,曹鵬

(泰興市人民醫(yī)院，江蘇泰興225400)

喉癌的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，其機(jī)制尚未完全闡明[1，2]。泛素特異性蛋白酶18(USP18)是一種干擾素信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)器，控制著Ⅰ型和Ⅲ型干擾素通路，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，并影響T淋巴細(xì)胞的凋亡途徑[3]。B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因3(BTG3)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抗增殖基因家族成員，參與修復(fù)損傷基因、維持基因穩(wěn)定等過(guò)個(gè)過(guò)程，其低表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力[4]。USP18、BTG3與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5，6]，但二者在喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌組織中USP18、BTG3的表達(dá)，并分析二者與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性，旨在為臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2015年7月在我院行手術(shù)切除治療的喉鱗狀細(xì)胞癌患者82例，男44例、女38例，年齡≥60歲42例、<60歲40例，腫瘤直徑≥3 cm 40例、<3 cm 42例，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期44例、Ⅲ～Ⅳ期38例，聲門上型24例、聲門型38例、聲門下型20例，分化程度高分化40例、中低分化42例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。術(shù)中另收集50例患者距腫瘤邊緣1 cm以上的正常喉黏膜組織作為對(duì)照，男27例、女23例，年齡≥60歲29例、<60歲21例?；颊咝g(shù)前均未行放、化療，術(shù)后病理檢查證實(shí)腫瘤組織為喉鱗狀細(xì)胞癌、癌旁組織為正常喉黏膜組織，排除其他部位腫瘤或嚴(yán)重器質(zhì)性病變。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 USP18、BTG3檢測(cè)方法 采用免疫組化法。收集手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本，加入4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切4 μm厚切片；常規(guī)脫蠟、脫水，檸檬酸高壓修復(fù)；滴加相應(yīng)的一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗；滴加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。以已知陽(yáng)性喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。USP18、BTG3均為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色程度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分。染色程度評(píng)分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無(wú)色為0分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積≥2為高表達(dá)，<2為低表達(dá)。

1.3 預(yù)后觀察方法 每3個(gè)月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括是否復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)時(shí)間、是否死亡、死亡時(shí)間。隨訪截止日期為2018年8月。總生存期定義為患者術(shù)后至任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間，無(wú)進(jìn)展生存期定義為患者術(shù)后到腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間，總生存率定義為隨訪結(jié)束時(shí)未死亡患者占總患者例數(shù)的比率，無(wú)進(jìn)展生存率定義為隨訪結(jié)束時(shí)疾病無(wú)進(jìn)展患者例數(shù)占總患者例數(shù)的比率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存時(shí)間曲線，以Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。單因素及多因素回歸分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP18、BTG3在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)比較 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中USP18、BTG3高表達(dá)率分別為37.80%(31/82)、45.12%(37/82)，癌旁正常組織分別為12.00%(6/50)、82.00%(41/50)。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中USP18高表達(dá)率高于癌旁正常組織，BTG3高表達(dá)率低于癌旁正常組織(P均<0.05)。

2.2 USP18、BTG3表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤直徑≥3 cm、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、中低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者USP18高表達(dá)率低于腫瘤直徑<3 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05)；腫瘤高分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者BTG3高表達(dá)率高于腫瘤中低分化、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 USP18、BTG3高表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系 USP18低表達(dá)患者的3年總生存率為90.32%(28/31)，3年無(wú)進(jìn)展生存率為80.66%(25/31)，高于USP18高表達(dá)患者的68.63%(35/51)、56.86%(29/51)(P均<0.05)。BTG3高表達(dá)患者的3年總生存率為89.19%(33/37)，3年無(wú)進(jìn)展生存率為83.78%(31/37)，高于BTG3低表達(dá)患者的71.11%(32/45)、60.00%(27/45)(P均<0.05)。

2.4 影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的單因素和多因素回歸分析結(jié)果 單因素COX分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、腫瘤直徑、臨床分期、USP18高表達(dá)、BTG3低表達(dá)與患者的生存時(shí)間有關(guān)，見(jiàn)表2。進(jìn)一步行多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤臨床分期、分化程度、USP18高表達(dá)、BTG3低表達(dá)是患者生存時(shí)間的影響因素(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 不同臨床病理參數(shù)的喉鱗狀細(xì)胞癌患者USP18、BTG3高表達(dá)率比較(%)

表2 影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的單因素COX回歸分析結(jié)果

表3 影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的多因素COX回歸分析結(jié)果

3 討論

喉癌的組織學(xué)類類型大部分為鱗狀細(xì)胞癌，其具體的發(fā)病原因及機(jī)制尚未闡明[7]。BTG3是抗增殖蛋白家族易位基因成員，位于第21號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶和2區(qū)1帶，是p53的下游靶標(biāo)，并在p53基因毒性應(yīng)激中被誘導(dǎo)，在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用，如細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化等，其表達(dá)水平下調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其水平上調(diào)可阻止細(xì)胞從G0/G1期到S期。USP18是泛素系統(tǒng)的重要成員，具有抑制細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)多種蛋白泛素化等功能。研究顯示，USP18和BTG3與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)[8，9]。

易禮智等[10]報(bào)道，USP18的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。布力布·吉力斯?jié)h等[11]報(bào)道，USP18的表達(dá)狀態(tài)與腫瘤的分期、浸潤(rùn)深度及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥3 cm、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、中低分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者USP18高表達(dá)率低于腫瘤直徑<3 cm、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，表明USP18高表達(dá)患者的腫瘤分化程度較低，腫瘤分期較晚，預(yù)示著這些患者的預(yù)后更差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性更大。而這些患者的腫瘤直徑更小，提示這些患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀的時(shí)間更晚，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和明確診斷的時(shí)間更晚。USP18高表達(dá)患者更多發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同樣預(yù)示USP18高表達(dá)患者的預(yù)后較差。

鄭華川等[12]報(bào)道，BTG3過(guò)表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期S/G2期阻滯、分化和自噬等過(guò)程，且其表達(dá)狀態(tài)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。呂赤等[13]報(bào)道，BTG3的表達(dá)狀態(tài)與結(jié)腸癌的組織學(xué)類型及分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腫瘤高分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者BTG3高表達(dá)率高于腫瘤中低分化、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。

研究顯示，USP18和BTG3的表達(dá)狀態(tài)與腫瘤患者的生存時(shí)間顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，USP18低表達(dá)患者的3年無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期均優(yōu)于USP18高表達(dá)患者。關(guān)于USP18低表達(dá)患者預(yù)后較高表達(dá)患者更好的原因:Zheng等[14]認(rèn)為，USP18表達(dá)下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并可增強(qiáng)化療藥物的治療效果，從而改善這部分腫瘤患者的預(yù)后；Yawen等[15]則認(rèn)為，USP18通過(guò)上調(diào)EGFR和激活A(yù)KT/SKP2途徑來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng);Duex等[16]研究顯示，USP18低表達(dá)可促進(jìn)miR-7表達(dá)上調(diào)，miR-7反過(guò)來(lái)抑制EGFR表達(dá)和癌細(xì)胞的致瘤活性，影響患者預(yù)后;另外有研究認(rèn)為，USP18可將泛蛋白樣蛋白ISG15與靶蛋白解偶聯(lián)，且作為Ⅰ型干擾素反應(yīng)的主要負(fù)調(diào)節(jié)劑，限制由Ⅰ型IFN和藥物引發(fā)的外源性凋亡途徑[17]，影響抗腫瘤藥物的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，BTG3高表達(dá)患者的3年無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期均優(yōu)于BTG3低表達(dá)患者。其機(jī)制可能與BTG3高表達(dá)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白E、p16、p27、NF-κB、p38 α/β、XIAP、Bcl-2、ATG14、p53等蛋白表達(dá)，通過(guò)抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。單因素和多因素COX回歸分析顯示，除腫瘤分期和腫瘤分化程度外，USP18高表達(dá)和BTG3低表達(dá)均為影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素。因此，USP18和BTG3均可能成為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的治療靶點(diǎn)，通過(guò)多種途徑抑制或阻斷兩者的功能，控制病情的進(jìn)展，改善患者的預(yù)后。另外，對(duì)于喉鱗狀細(xì)胞癌患者，可通過(guò)檢測(cè)USP18和BTG3的表達(dá)狀態(tài)，對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

綜上所述，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中USP18表達(dá)升高，BTG3表達(dá)降低；USP18、BTG3表達(dá)狀態(tài)與臨床病理特征具有明顯相關(guān)性，USP18高表達(dá)、BTG3低表達(dá)是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。