朱昌豐，曾枝東

廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院(福田)(深圳518034)

甘草又稱為國老、甜草，屬于多年生草木，是一種補益中草藥，藥用部位多為根及其根莖，多呈圓柱狀，長為25～100 cm，外皮松緊不一，具有清熱解毒、祛痰止咳等功效[1]。而甘草油屬于臨床常用的中藥方劑，主要由甘草與香油構(gòu)成，多用于解毒、潤膚、創(chuàng)面清潔等功效[2]。但是，近年來隨著臨床對于甘草需要的進一步擴大，導(dǎo)致野生資源的甘草難以滿足不斷增殖的需求，使得人們開始尋找其他方法提高甘草的使用率[3]。國內(nèi)學者研究表明[4-5]：甘草油主要由甘草組成，而甘草中則含有相對豐富的黃酮類化合物，據(jù)歐抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用，但是臨床上對于甘草油的質(zhì)量標準缺乏研究。因此，加強甘草油的質(zhì)量標準建立能為臨床合理使用甘草油提供依據(jù)和參考。本研究將以甘草油為對象，探討甘草油的質(zhì)量標準，現(xiàn)報告如下。

資料和方法

1 儀器、設(shè)備與試劑 儀器與設(shè)備：①高效液相色譜儀(美國科學系統(tǒng)公司)；②色譜工作站。③智能藥物檢測儀。④純凈水、甘草油(由我院自主研制)、甲醇-水(27∶23)；⑤色譜柱：Kromasil C18柱流動相，色譜純、硫酸二化鈉、硫酸鈉，分析純。試劑：甘草苷對照品(標準品由中國食品藥品鑒定研究院提供)、甲醇(美國SPS公司生產(chǎn)、提供，HPLC級)、純凈水、分析純；購置三種黃精藥材，經(jīng)過鑒定后均為甘草根莖(干燥)。

2 檢測方法

2.1 甘草油及甘草苷鑒別:甘草油的鑒別。取甘草油3 g，加入20 ml乙醚，加熱后進行30 min回流，去除乙醚液，并向殘渣中加入20 ml甲醇，連續(xù)進行30 min回流，濾過，將溶液濃縮為4 ml，作為供試品液，以同樣方法制備陰性對照液。同時，取甘草苷0.5 g，以相同方法制備對照藥材溶液。參考《中藥藥典》2010年中薄層色譜法吸取3～5 μl上述溶液，分別將其放置在硅膠G薄層板中，晾干后噴濃度為5%三氯化鋁乙醇溶液，紫外線下觀察(圖1)[6]。

注： 1為陰性對照溶液；2～4為供試品溶液；5為對照藥材

2.2 甘草苷的鑒別:取甘草苷2 g，加入20 ml乙醚，加熱后進行15 min回流，去除乙醚液，并向殘渣中加入20 ml甲醇，連續(xù)進行30 min回流，濾過，將溶液濃縮為5 ml，作為供試品液，以同樣方法制備陰性對照液。同時，取甘草油1.0 g，以相同方法制備對照藥材溶液。參考《中藥藥典》2010年中薄層色譜法吸取3～5 μl上述溶液，分別將其放置在硅膠G薄層板中，晾干后噴濃度為5%三氯化鋁乙醇溶液，紫外線下觀察(圖2)[7]。

3 HPLC法測定甘草油

3.1 色譜條件：色譜柱為Apollo C18；流動相：A

相為乙腈，B 相為 0.1%磷酸水溶液，檢測過程中采用梯度洗脫程序進行，見表1?？刂屏魉贋?.0 ml/min，波長346 nm，柱溫30℃。進樣量均為10 μl，見表2。

注： 1為陰性對照溶液；2～4為供試品溶液；5為對照藥材

時間(min)乙腈(%)0.1%磷酸水(%)0208054060204060

3.2 對照品溶液制備：精密稱取甘草油與甘草苷80 g，將其放置在50 ml量瓶中，采用色譜甲級甲醇將不同的樣品完全溶解，并對藥物進行定容，混合均勻后完成甘草油220.6 mg/l標準儲備液的測定。精密稱取甘草油與甘草苷0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ml，將其分別放置在10 ml量瓶中，獲得2.2、11.0、22.1、55.2、110.3及220.6 mg/L的標準溶液(圖3)。

3.3 線性關(guān)系考察：分別稱取對照標準品溶液(0.518 mg/ml)0.3 ml、0.4 ml，將其放置在容量為5 ml的容量瓶中，加入甲醇，稀釋，最終獲得溶液濃度為31.08%和41.44 μg/ml的對照品溶液；精密吸取0.4 ml、0.518 mg/ml對照品儲備液，放入10 ml量瓶中，向量瓶中加入甲醇對溶液進行稀釋，直到刻度后混合均勻，加入1 μl待測樣品，獲得色譜峰面積?；貧w方程：A=3072078,X-11741，r=0.9993。提示：甘草油中含量在0.1295～0.5180μg，具有良好的線性關(guān)系[8-9]。

3.4 精密度試驗：分別稱取不同甘草油6次，根據(jù)上述色譜條件進行重復(fù)6次測定，獲得峰面積值，RSD分別為：0.43%、0.48%、0.33%、0.55%、0.61%及0.48%，提示：儀器精密度好[10]。

圖3 高效液相色譜圖

3.5 穩(wěn)定性考察：分別稱取不同甘草油6次，根據(jù)上述色譜條件在0、3、6、9、12、15 h進行樣，測定峰面積值，RSD分別為0.57%、0.57%、0.46%、0.57%、0.70%、0.51%，提示：樣品溶液中甘草油中黃酮含量在15h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3.6 重復(fù)性試驗:分別稱取不同甘草油6次，采用供試品溶液制備方法操作，平行制備6份，在上述色譜條件下測定峰面積值，計算平均質(zhì)量濃度及RSD值。結(jié)果分別為：21.8 μg/ml及1.03%、107.1 μg/ml及1.12%、9.5 μg/ml及1.08%、107.1 μg/ml及1.12%、9.5 μg/ml及1.08%、28.3 μg/ml及0.9%、0.5 μg/ml及1.28%和5.2 μg/ml及1.11%。由此看出：該方法具有良好的可重復(fù)性。

3.7 回收率試驗:分別稱取不同甘草油，精密稱取0.5 g，分別精密加入5 ml濃度為40 μg/ml 5-HMF對照溶液，并加入甲醇保證溶液整體為25 ml，制備供試品溶液，在色譜條件下完成峰面積的測定，計算甘草油中黃酮含量，平均回收率為97.47%，RSD為2.1%。

3.8 定量限與檢測限：選取對照品溶液，根據(jù)合適的比例稀釋后完成定量限與檢測限檢測。對于信噪比=10，黃酮含量為1.41 mg/g；對于信噪比=3，黃酮含量為1.39 mg/g。

結(jié) 果

1 不同試驗次數(shù)下甘草油中黃酮含量比較 本研究中對甘草油進行6次測量，在不同選擇溶液及參比溶液，將其放置在337 nm部位完成吸光度值A(chǔ)的測定，結(jié)果表明：不同吸光度下甘草油中總黃酮含量存在明顯的差異，均集中在13.2096～20.0451 mg，平均值為1.81%，見表2。

表2 不同試驗次數(shù)下甘草油中黃酮含量比較

2 不同試驗次數(shù)下甘草油中甘草苷及甘草酸水平測定結(jié)果比較 精密稱取10 μl甘草油放入液相色譜儀中，利用外標法測定甘草油中甘草苷及甘草酸含量，結(jié)果表明：不同試驗下甘草油中甘草苷與甘草酸含量存在明顯的差異性，甘草苷含量主要集中在0.1143～0.3743 mg，甘草酸含量為5.5433～6.3571 mg，見表3。

表3 不同試驗次數(shù)下甘草油中甘草苷及甘草酸水平測定結(jié)果比較

討 論

甘草是臨床上常有的中藥材，具有廣泛的藥用價值，多用于心氣虛、心悸怔忡、胃痛、氣喘咳嗽等藥物，能調(diào)和某些藥物的烈性，且藥物具備類似腎上腺素激素作用[11-12]。而甘草油是臨床上常用外用藥，處方包括：甘草1兩及香油10兩，將甘草浸潤到香油中24 h，文火將藥炸成焦黃，經(jīng)過去渣后制備得到，藥物具有清熱解毒、潤膚等多種功效。但是，隨著我國臨床對于甘草需求的日益增大，導(dǎo)致自然甘草量難以滿足臨床需求。因此，加強甘草油質(zhì)量標準建立對提高甘草利用率具有重要的意義[13]。

薄層鑒別法是藥物質(zhì)量標準建立中常用的方法，鑒別時將適宜的固定相涂抹在玻璃板、塑料或鋁片上，從而形成均勻的薄層，展開后根據(jù)比移植與適宜的對照物進行對比，從而完成藥品的鑒別、含量的測定。本研究中，對甘草油進行6次測量，在不同選擇溶液及參比溶液，將其放置在337nm部位完成吸光度值A(chǔ)的測定，結(jié)果表明：不同吸光度下甘草油中總黃酮含量存在明顯的差異，均集中在13.2096 g～20.0451 mg，平均值為1.81%。由此看出：甘草油中富含總黃酮，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等效果。但是，本實驗中薄層色譜中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是多方面的，可能是由于薄層鑒別法使用時硅膠表明具有相對較多的硅膠基，而硅膠基屬于親水性基團，容易與水相互結(jié)合，從而形成水合硅膠醇，在一定程度上影響硅膠的活性。同時，溫度過高也會引起水與待分離的成分競爭硅醇基，均會引起拖尾，均需要進一步研究與探討[14]。

為了進一步建立甘草油的質(zhì)量標準，研究中采用紫外分光光度計完成甘草油中總黃酮測定，通過薄層鑒別法完成甘草油中甘草苷與甘草酸含量測定，結(jié)果表明：精密稱取10 μl甘草油放入液相色譜儀中，利用外標法測定甘草油中甘草苷及甘草酸含量，結(jié)果表明：不同試驗下甘草油中甘草苷與甘草酸含量存在明顯的差異性，甘草苷含量主要集中在0.1143～0.3743 mg，甘草酸含量為5.5433～6.3571 mg。由此看出：甘草油中含有相對較多的甘草酸及甘草苷，能較高的反應(yīng)甘草油的藥用價值，并且該方法相對簡單、易行。但是，紫外分光光度計及薄層鑒別法測定時不同試驗次數(shù)之間存在明顯的差異性，出現(xiàn)這種現(xiàn)象原因是多方面的，可能與測定的時間、藥物的類型、產(chǎn)地及采集時間不同有關(guān)。同時甘草油不同的生產(chǎn)廠家、標準不同均會對總黃酮、甘草苷及甘草酸含量均會產(chǎn)生影響。因此，臨床上急需制定確切的質(zhì)量標準，進一步規(guī)范甘草油中總黃酮、甘草苷及甘草酸含量，避免甘草的浪費，進一步提高甘草藥物劑量，在滿足臨床治療需要的前提下盡可能減少甘草劑量[15]。

綜上所述，本研究起草的甘草油質(zhì)量標準更加貼近我國現(xiàn)狀，具有操作簡單、方法準確、可靠等優(yōu)點，具備良好的專屬性、準確性，能有效的控制甘草油藥材質(zhì)量，值得推廣應(yīng)用。