惠建榮，張 瑞

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 (咸陽712083)

目前，腦卒中已經(jīng)成為世界各國的常見和多發(fā)疾病，對(duì)全人類的健康和生命產(chǎn)生了巨大的威脅，其發(fā)病特點(diǎn)可概括為“四高一多”(高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、并發(fā)癥多)[1-4]，它與心臟病、惡性腫瘤成為了導(dǎo)致人類死亡的三大主要因素。缺血性和出血性是腦卒中的兩大主要類型，目前缺血性腦卒中在臨床上較為多見，約占全部腦卒中的2/3[5-6]。目前，Notch信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展中的研究已受到廣泛關(guān)注。其中Notch信號(hào)通路參與腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)制的研究正日益受到重視，前期已有研究表明Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)缺血性腦損傷后源性神經(jīng)元的增殖和分化發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，因而備受關(guān)注。

本次實(shí)驗(yàn)中，在“少陽主樞”的理論基礎(chǔ)上提出利樞針刺法，選取少陽經(jīng)的穴位外關(guān)、陽陵泉，并從行為學(xué)、細(xì)胞及分子學(xué)等方面觀察利樞針刺法對(duì)模型大鼠Notch信號(hào)通路Jagged1蛋白表達(dá)的影響及作用機(jī)制，從而探討利樞針刺法是否可通過激活Notch信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化及腦缺血后受損神經(jīng)元的再生，以揭示利樞針刺法在腦缺血治療中的作用機(jī)理，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療腦缺血提供新的思路及方法。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康雄性SD大鼠60只，體重200～250 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜) 2012-003，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要儀器、試劑及藥物 電子天平(上海，型號(hào)：FA2004A)、電熱恒溫水槽(上海，型號(hào)：DK-8AD)、臺(tái)式離心機(jī)(湖南，型號(hào)：TL-4)、內(nèi)切式勻漿機(jī)(寧波，型號(hào)：XHF-D)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國，型號(hào)：EON)；兔抗鼠Jagged1多克隆抗體、β-actin、HRP-山羊抗兔IgG、RIpA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白預(yù)染 marker均購置于武漢博士德生物有限公司，胞二磷膽堿購置于齊魯有限公司。

3 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

3.1 大腦中動(dòng)脈阻塞(Middle cerebral artry occlusion，MCAO)造模及分組：造模前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。術(shù)前均禁食12 h，后選取10只大鼠只游離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈作為假手術(shù)對(duì)照組，剩余50只大鼠參照Zea-Longa等[7]的方法以線栓法制作MCAO局灶性腦缺血模型。將麻醉大鼠仰臥位固定，用手術(shù)刀在頸部正中切口，沿右側(cè)頸部肌肉及筋膜分離出右側(cè)頸部動(dòng)脈(頸內(nèi)、頸外、頸總)，把頸外動(dòng)脈結(jié)扎后于近心端將頸總動(dòng)脈結(jié)扎，并將頸內(nèi)動(dòng)脈用微動(dòng)脈夾夾閉。用剪刀在頸總動(dòng)脈分叉約3 mm處剪一小口，將制備好的魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，將拴線緩慢推進(jìn)，插入深度約在18 mm時(shí)將微動(dòng)脈血管夾取下，在切口稍上方部位結(jié)扎，消毒，縫合切口，MCAO模型即完成。后將模型制備成功大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、利樞機(jī)針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組。

3.2 干預(yù)方法：假手術(shù)組、模型對(duì)照組每日抓拿1次，常規(guī)消毒外關(guān)、陽陵泉2個(gè)穴位；利樞針刺組，針刺外關(guān)、陽陵泉，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]并結(jié)合人體同身寸取穴法；普通針刺組，針刺百會(huì)、大椎(按高等針灸學(xué)教材7版取穴)；西藥灌胃組給予胞二磷膽堿0.4 g/kg用生理鹽水稀釋至2 ml灌胃。

針刺方法：穴位常規(guī)消毒后，選用0.5寸毫針刺入，其中外關(guān)直刺2 mm，陽陵泉直刺6 mm，百會(huì)向前斜刺2 mm，大椎直刺5 mm，留針時(shí)間15 min，留針期間施平補(bǔ)平瀉手法1次。各組治療以24 h為1個(gè)周期，1次/d，連續(xù)治療14 d。

4 觀察指標(biāo)及方法

4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：參照Zea-Longa[7]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別于造模后的1、3、7及14 d對(duì)模型大鼠進(jìn)行評(píng)分。4分：不能自發(fā)行走，昏睡、意識(shí)喪失、痙攣；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；2分：行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；1分：無法完全伸展左側(cè)前肢；0分：無神經(jīng)缺損癥狀。除假手術(shù)組外，術(shù)后1 d神經(jīng)功能評(píng)分在1～3分表示造模成功，0分和4分表示造模失敗，予以剔除。

4.2 腦梗死體積百分比的測定：干預(yù)結(jié)束后，各組各選大鼠5只，麻醉后灌注取腦，于-20℃冰箱冰凍約15 min后進(jìn)行冠狀切片(每片約2 mm)，將切好的腦片置于1%的TTC(取1 gTTC粉末，用PBS充分溶解后定容到10 ml)溶液中，在37℃恒溫孵育箱內(nèi)放置20 min，使之均勻染色。之后用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，在低溫下(4℃)固定24 h后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，無梗死區(qū)域?yàn)榉奂t色，有梗死區(qū)域則為白色。采用Adobe photoshop7.0圖像處理軟件測定每一片腦組織的梗死面積，根據(jù)相應(yīng)公式[校正腦梗死體積百分比=(對(duì)側(cè)腦組織體積-缺血側(cè)正常腦組織體積)÷對(duì)側(cè)腦組織體積×100%]計(jì)算梗死面積。

4.3 Jagged1蛋白表達(dá)測定:采用WB(Western blotting)測定Jagged1蛋白的表達(dá)，將各組剩余的5只大鼠，于干預(yù)結(jié)束后取右側(cè)大腦海馬，提取總蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度。變性后取40 μg電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，加入兔抗鼠Jagged1多克隆抗體，4℃封閉過夜。第二天從4℃取出膜，洗膜3次，每次10 min，后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫輕搖1 h，洗膜3次，每次10 min，后用ECL顯影，于暗室中感光，定影后利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參照，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，檢測數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 各組大鼠術(shù)后1、3、7及14 d神經(jīng)功能缺失計(jì)分及其比較，神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：假手術(shù)組無神經(jīng)功能的缺失，其他各組神經(jīng)功能的評(píng)分在術(shù)后1、3 d下降無明顯差異，術(shù)后7、14 d下降比較明顯，利樞針刺組及普通針刺組在治療第14天后的神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型對(duì)照組、西藥灌胃組，有顯著性差異(P<0.01)；且利樞針刺組與普通針刺組比較也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1)。

2 TTC染色結(jié)果 各組模型大鼠腦組織經(jīng)TTC染色可見：假手術(shù)組的腦片全部紅染，無蒼白梗死灶形成，模型對(duì)照組、利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組大鼠的腦組織出現(xiàn)蒼白的梗死灶，提示造模成功。四組與假手術(shù)組對(duì)比(P<0.01)，差異顯著；利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組三組分別與模型對(duì)照組比較(P<0.01)，具有顯著差異；利樞針刺組、普通針刺組分別于與西藥灌胃組對(duì)比(P<0.01)，差異有顯著性；將兩個(gè)針刺組進(jìn)行對(duì)比(P<0.01)，有明顯差異。術(shù)后14 d，分別對(duì)各組大鼠的腦組織進(jìn)行TTC染色，染色圖片(圖2)，梗死體積百分比結(jié)果(圖3)。

3 各組大鼠Jagged1蛋白的表達(dá) 對(duì)缺血性模型大鼠治療14 d后，經(jīng)Western blot檢測后，各組Jagged1的表達(dá)結(jié)果顯示，各組治療14 d后Jagged1的表達(dá)，余四組與假手術(shù)組相對(duì)比，Jagged1的表達(dá)均增多，其中模型對(duì)照組與之存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組分別與假手術(shù)組對(duì)比(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；將利樞針刺組、普通針刺組、西藥灌胃組分別與模型對(duì)照組對(duì)比(P<0.01)，差異仍具有顯著性；利樞針刺組、普通針刺組分別與西藥灌胃組對(duì)比(P<0.01)，差異也十分明顯；兩個(gè)針刺組之間對(duì)比也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4、5)。

圖1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分

圖2 各組大鼠腦組織TTC染色

圖3 腦梗死體積百分比

圖4 Western blot檢測Jagged1蛋白的表達(dá)

圖5 Jagged1蛋白的表達(dá)

討 論

通利樞機(jī)針刺法是以“少陽主樞”、“少陽樞機(jī)不利”為理論基礎(chǔ)的，作為六經(jīng)之一的少陽，可以協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)太陽及陽明的功能，對(duì)于陰陽的平衡、表里的開闔同樣也發(fā)揮著重要的作用，故曰“少陽主樞”。調(diào)節(jié)全身陽氣出入、調(diào)節(jié)人體氣機(jī)升降、調(diào)節(jié)人體陰陽的出入則是少陽樞機(jī)作用的三個(gè)主要方面。只有少陽樞機(jī)作用發(fā)揮正常的調(diào)節(jié)作用，使人體氣機(jī)出入正常，升降自如，開闔有度，機(jī)體的生命活動(dòng)才得以正常進(jìn)行，協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)，取少陽經(jīng)穴以通利樞機(jī)，血脈流行正常，則一切中風(fēng)之象，自可消除。本實(shí)驗(yàn)針刺選穴外關(guān)與陽陵泉，其中外關(guān)穴為手少陽三焦經(jīng)脈上的絡(luò)穴，且與足少陽膽經(jīng)的足臨泣通陽維脈，陽維主諸陽，可以調(diào)節(jié)全身陽經(jīng)經(jīng)氣，所以取外關(guān)能治療下肢的病證，還能調(diào)節(jié)全身氣血及陽經(jīng)陽氣。陽陵泉不但是足少陽膽經(jīng)的合穴，也是膽腑的下合穴，總的來說有宣發(fā)和疏調(diào)之的功效，故一者可以治療本經(jīng)病，二者能治療膽腑的病變，三者還可治療筋脈麻痹。由于氣機(jī)升降逆亂是中風(fēng)發(fā)生的關(guān)鍵，故取陽陵泉能調(diào)整其升降失衡之氣機(jī)，同時(shí)該穴為八會(huì)穴之筋會(huì)穴，能柔筋舒筋，通調(diào)氣血，通痹止痛，常用于中風(fēng)偏癱的治療。

Notch信號(hào)通路是一種經(jīng)典的信號(hào)通路，該通路的家族成員結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性[9]。Jagged1是表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的特異性單次細(xì)胞跨膜蛋白，它是細(xì)胞膜上Notch受體的關(guān)鍵配體。研究表明，Jagged1表達(dá)的增加可以促使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，達(dá)到修復(fù)神經(jīng)元以及促進(jìn)其再生的作用，從而使神經(jīng)元的存活率提高[10]。

本實(shí)驗(yàn)為了探討利樞針刺法對(duì)于Notch信號(hào)通路中配體Jagged1的表達(dá)的影響以及作用機(jī)制，從行為學(xué)、細(xì)胞及分子水平進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)利樞針刺法可以改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分以及大腦梗死面積，并提示利樞針刺可增加Jagged1的表達(dá)，激活Notch信號(hào)通路，從而使NSCs更多的向神經(jīng)元分化以促進(jìn)大鼠腦缺血后海馬區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞再生以發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)作用，從而達(dá)到治療腦缺血的治療作用。