李永濤，董玉峰，王振猛，張鵬遠(yuǎn)，王衛(wèi)東，荀守華，秦光華，姜岳忠

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院 山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟(jì)南 250014）

楸 樹Catalpa bungeiC.A.Mey.為紫葳科Bignoniaceae 梓樹屬Catalpa落葉喬木，原產(chǎn)中國，現(xiàn)主要分布于我國暖溫帶和亞熱帶地區(qū)，為我國特有梓樹屬植物[1]。其材質(zhì)優(yōu)良，樹姿優(yōu)美，用途廣泛，是珍貴觀賞和用材樹種，有“木王”之稱[2]。楸樹在我國已有2 000 多年栽培史，有關(guān)楸樹的研究較多，目前主要集中在開發(fā)利用、良種選育及抗逆機(jī)理研究等方面[3-6]。魯豫地區(qū)作為楸樹重要的適生分布區(qū)，在其區(qū)域內(nèi)均有廣泛分布，但由于地理隔離、遺傳漂變和人工選擇等原因，在形態(tài)特征、生態(tài)適應(yīng)性及生長表現(xiàn)等方面形成了明顯差異[3]。目前僅通過枝、葉、花和種實(shí)等簡單形態(tài)表型標(biāo)記已不能準(zhǔn)確將其區(qū)分開來，形態(tài)學(xué)標(biāo)記雖簡便易行，但由于表型性狀易受環(huán)境因素影響、近緣種較難區(qū)分，因此以形態(tài)特征作為分類的依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)具有不確定。而近年來，通過對野生資源的選擇利用，楸樹已成為重要的鄉(xiāng)土樹種和珍貴優(yōu)質(zhì)用材樹種，準(zhǔn)確地鑒別種質(zhì)資源間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，對其種質(zhì)資源的充分發(fā)掘及利用具有重要的意義。

分子標(biāo)記技術(shù)因不受組織類型、發(fā)育時期、環(huán)境條件等因素的影響，直接以DNA 形式表現(xiàn)，現(xiàn)已成為目前最有效的遺傳分析方法[7]。其中AFLP（Amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合了RFLP 技術(shù)的可靠性和PCR 技術(shù)的高效性，多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高，可完全用于研究背景模糊、材料來源廣泛等資源的標(biāo)記分析[8-9]。目前已被廣泛應(yīng)用于白蠟屬[10]、獼猴桃屬[11]、蘋果[12]和檉柳[13]等種質(zhì)資源的遺傳分析研究。在楸樹方面，早前國內(nèi)外學(xué)者采用ISSR、SRAP 和SSR 標(biāo)記技術(shù)[14-16]，對部分區(qū)域資源的遺傳多樣性做了一些研究，而暫未涉及利用AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)對楸樹資源進(jìn)行鑒定分析。為深入了解魯豫地區(qū)楸樹種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究采用AFLP 標(biāo)記技術(shù)對該區(qū)域分布的44份優(yōu)良楸樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期了解不同地理、生態(tài)條件下的遺傳變異狀況，為楸樹優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、鑒別和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料保存于山東省光合園林章丘白云湖基地楸樹資源圃和棗園苗圃內(nèi)，該材料于2002—2004年期間從山東、河南2 省的多個縣、市、地區(qū)采集，通過嫁接保存于資源圃內(nèi)。其中，山東省采集種質(zhì)33份（優(yōu)良單株），河南省采集種質(zhì)11份（包括豫楸1 號、豫楸1 號、周楸2 號3 個省級良種和8 個優(yōu)良單株），共計44份，供試材料的編號、名稱及來源詳見表1。每一種質(zhì)采集適量新鮮幼嫩葉片，放入裝有硅膠的自封袋中干燥保存，用于DNA 的提取。

表1 供試材料及來源Table1 Experiment materials and their origin

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取

采用CTAB 法提取楸樹幼嫩葉片中DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFLP 擴(kuò)增及檢測

限制性酶切及連接反應(yīng)：酶切與連接同時進(jìn)行，利用PstI 和MseI 內(nèi)切酶構(gòu)建酶切連接體系，反應(yīng)體系為DNA 模板4 μL（50 ng/μL）、Adapter 1 μL、PstI /MseI 2 μL、10×Reaction buffer 2.5 μL、10 mmol ATP 2.5 μL、T4 Ligase 1 μL、ddH2O 7 μL 共計20 μL。將混合液混勻離心數(shù)秒，37 ℃保溫酶切5 h，之后8℃保溫酶切4 h，4 ℃連接過夜。

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)：選擇PstI（5′-GACTGCGTACAT GCAG-3′）和MseI（5′-GATGAGTCCTGAGTAC-3′）為預(yù)擴(kuò)增引物。連接產(chǎn)物20 倍稀釋后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為預(yù)擴(kuò)增模板DNA 2 μL、預(yù)擴(kuò)引物 1 μL、dNTPs 0.5 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、Taq 酶 0.5 μL 以及ddH2O 18.5 μL 共計25 μL。預(yù)擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min，終止于4 ℃。

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)：將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20 倍，采用PstI、MseI 引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為預(yù)擴(kuò)稀釋樣品 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、PstI 引 物1 μL、MseI 引 物1 μL、Taq 酶0.5 μL 以及ddH2O 17.5 μL 共計25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，1 個循環(huán)；然后以每循環(huán)復(fù)性溫度逐級降低0.7 ℃的梯度繼續(xù)12 個循環(huán)；接著按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，擴(kuò)增23 輪；最后再72 ℃延伸5 min，反應(yīng)終止于4 ℃。

PCR 擴(kuò)增在Gene Amp PCR System 9600 擴(kuò)增儀上完成，內(nèi)切酶和連接酶均購自New England Biolabs 公司，引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物變性后在4%聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳分離，染色顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

電泳結(jié)果采取0/1 賦值記帶法，有帶的記為1，無帶的記為0。采用POPGENE version 1.32 軟件計算多態(tài)性條帶（N）、多態(tài)性條帶比率（PPB）、Nei’s 基因多樣度（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon 信息指數(shù)（I）等遺傳多樣性指標(biāo)；利用NTSYSpc-V.2.1 計算遺傳相似性系數(shù)；根據(jù)相似性系數(shù)進(jìn)行UPGMA 聚類分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取結(jié)果及檢測

通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），所提取試驗(yàn)材料的DNA 帶清晰，無降解和RNA 污染。DNA 樣品經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測OD260/OD280在1.792～1.859 之間，說明CTAB 法所提取楸樹DNA 的純度和濃度較高，其質(zhì)量符合AFLP 分子標(biāo)記試驗(yàn)分析要求。

圖1 基因組DNA 檢測Fig.1 Genomic DNA detection

2.2 酶切連接反應(yīng)及預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

采用PstI/MseI 酶切組合對獲得的楸樹基因組DNA 同時進(jìn)行酶切與連接反應(yīng)，通過不同時間梯度下的雙酶切效果看出（圖2），酶切1 h 即可將楸樹DNA 樣品切割開，其中1～2 h 效果相近，3～6 h 酶切更充分，8～10 h 條帶開始減弱。0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示，酶切1～6 h DNA 條帶均彌散均勻，所得產(chǎn)物均符合下一步預(yù)擴(kuò)增要求。

圖2 酶切時間梯度對比效果圖像 Fig.2 Effects of double enzyme time gradient

通過建立楸樹預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系看出（圖3），預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物彌散片段主要分布在2 000 bp 以內(nèi)，預(yù)擴(kuò)增條帶呈彌散型分布，各楸樹種質(zhì)帶型明顯且比較一致。預(yù)擴(kuò)增結(jié)果表明接頭與雙酶切片段已連接成功，可為下一步選擇性擴(kuò)增的順利進(jìn)行提供模板。

圖3 預(yù)擴(kuò)增電泳圖像Fig.3 Electrophoresis pattern of pre-amplified product

2.3 AFLP 擴(kuò)增結(jié)果分析

從 64 對 AFLP 引物中篩選出8 對擴(kuò)增條帶清晰并呈多態(tài)性的引物，對44 個楸樹單株的DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增（表2）。篩選出的8 對引物組合共擴(kuò)增出條帶1 087 條，其中多態(tài)性條帶1 043條，多態(tài)性條帶比率在92.37%～99.40%，其中P-GTG/M-CAG 引物組合效率最高，P-GAT/M-CTG 引物組合最低，平均為95.60%；每條引物平均擴(kuò)增出的條帶數(shù)為135.88 條，而平均多態(tài)性條帶為130.38 條。擴(kuò)增條帶數(shù)最多的是P-GTG/M-CAG 引物組合，為168 條，最少的是P-GTG/M-CTC 引物組合，為在114 條；每個位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)為1.321 0，Nei’s 平均基因多樣性為0.200 3，Shannon 平均信息指數(shù)為0.320 4。

引物組合P-ACG/M-CAC 的擴(kuò)增圖譜顯示（圖4），所得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、數(shù)量較多、易于分辨，表明所選用的引物組合多態(tài)性較好。

表2 8對引物組合（PstI/MseI）擴(kuò)增的AFLP 條帶結(jié)果?Table2 Amplification bands with eight pairs of AFLP primer

圖4 引物組合 P-GAA/M-CAA 對c1-c30 號楸樹資源的AFLP 擴(kuò)增圖譜Fig.4 AFLP fingerprinting of the primer combination P-GAA/M-CAA for No.c1-30 Catalpa bungei

2.4 特異性條帶分析

通過AFLP 標(biāo)記對44份楸樹種質(zhì)資源的分析，8 對引物組合共產(chǎn)生特異性條帶261 條。不同引物組合擴(kuò)增出的特異性條帶數(shù)存在一定差異，其中產(chǎn)生特異性條帶最多的引物組合為P-GTG/M-CAG，共產(chǎn)生47 條特異性條帶，產(chǎn)生特異性條帶數(shù)最少的引物組合為P-GAA/M-CTG，共擴(kuò)增出4 特異性條帶。44份楸樹種質(zhì)產(chǎn)生的特異性條帶也不相同，其中產(chǎn)生特異性條帶數(shù)最多種質(zhì)的是c18 號和c34 號，均有16 條帶，分別位于山東海陽和河南洛陽市洛寧縣；其次是c5 號和c38 號種質(zhì)，各有15 條特異性條帶，分別位于山東萊陽和河南三門峽市陜縣；特異性條帶數(shù)在10 條以上（包括10 條）的材料有3 個，為c1 號、c3 和c40號，分別位于山東臨沂市蒙陰縣、萊陽市及河南周口市；特異性條帶最少的種質(zhì)為c6 號、c12 號、c25、c28、c30 和c44 號，均有1 條特異性條帶，通過這些特異性條帶可對楸樹資源進(jìn)行較好的區(qū)分和鑒別。

2.5 遺傳相似性分析

通過分析44份楸樹種質(zhì)資源間的遺傳相似性系數(shù)，遺傳相似性系數(shù)為0.502 2～0.791 9，平均值為0.652 7。由相似系數(shù)矩陣看出，44份種質(zhì)材料中c5 號與c34 號種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.502 2，兩者分別位于山東萊陽和河南洛陽市洛寧縣地區(qū)，表明兩者遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，差異性最大。c6 號與c7 號種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.791 9，而兩者均分布山東省蒙陰地區(qū)，遺傳關(guān)系最近，差異性最小。同時，c6 號種質(zhì)與其它種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)平均值最大，為0.688 5；c43 號種質(zhì)與其它種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)平均值最小，為0.626 9。表明c6 號與其它種質(zhì)材料間具有較高的遺傳相似性，親緣關(guān)系較近；而c43 號與其它種質(zhì)材料間的遺傳相似性較小，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.6 聚類分析

基于遺傳相似系數(shù)，通過UPGMA 法對44份楸樹種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析得出（圖5），在相似系數(shù)0.65 處，可將44份楸樹資源分為5 大組。第1 組由17 個種質(zhì)組成，包括15 個山東種質(zhì)和2個河南種質(zhì)。其中c1、c8 號種質(zhì)位于蒙陰地區(qū)，c3、c5、c10、c30 號位于萊陽地區(qū)，c13、c19～c21 號位于青州地區(qū)，c15 號位于海陽地區(qū)，c22、c24～c26 號位于臨朐地區(qū)，c43 和c44 號位于河南省洛寧縣地區(qū)；第2 組由21 個種質(zhì)組成，包括18 個山東種質(zhì)和3 個河南種質(zhì)。其中c2、c4、c6、c7、c11、c12 號位于蒙陰地區(qū)，c9 號位于萊陽地區(qū)，c14、c16、c17、c18 號位于海陽地區(qū)，c23 號位于臨朐地區(qū)，c27、c28、c29、c31、c32、c33 號位于萊陽地區(qū)，c35 號則位于河南省陜縣地區(qū)，c41、c42 號位于河南省洛寧縣長水鎮(zhèn)地區(qū)；第3 組包括3 個種質(zhì)，均來自河南地區(qū)，其中c37號種質(zhì)位于河南省洛陽市伊川縣地區(qū)，而c39、c40 號則位于河南省周口市地區(qū)；第4 組僅包括1個種質(zhì)，為c38 號，來源于河南省三門峽市陜縣地區(qū)；第5 組包括2 個種質(zhì)，為c34 和c36，2 個種質(zhì)都位于河南省洛寧縣地區(qū)。從聚類分析結(jié)果可以看出，44份楸樹種質(zhì)材料的分組與其地理分布位置并不完全一致，部分來源于同一地區(qū)的種質(zhì)卻被分在不同的分組中。

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性是物種長期進(jìn)化而產(chǎn)生的結(jié)果，是生物生存、發(fā)展和進(jìn)化的前提[18]。AFLP 為一種高效的分子標(biāo)記方法，可準(zhǔn)確反映物種間的遺傳變異情況及親緣關(guān)系遠(yuǎn)近等信息[19]。本研究通過AFLP標(biāo)記技術(shù)經(jīng)DNA 提取、酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增等步驟（圖1～圖3），利用篩選到的8 對引物組合，在44份楸樹種質(zhì)上均能得到清晰的AFLP 指紋圖譜（圖4），表明AFLP 技術(shù)可穩(wěn)定、有效地對不同來源的楸樹種質(zhì)資源進(jìn)行區(qū)分。同時，8 對引物共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶1 087 條，多態(tài)性比率（PPB）為92.37%～99.40%，平均值為95.60%，位點(diǎn)多態(tài)性較好，有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性（H）和Shannon 信息指數(shù)（I）分別達(dá)到了1.321 0、0.200 3 和0.320 4，擴(kuò)增結(jié)果顯示楸樹種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。這與石欣等[15]采用14 對ISSR 引物對156 個楸樹單株擴(kuò)增所得97.89% 的多態(tài)性比率較相近，而略低于方樂成等[17]采用13 對SSR 引物對192份楸樹資源擴(kuò)增所得99%的多態(tài)性比率。采用不同的分子標(biāo)記方法獲得多態(tài)性存在差異，遺傳多樣性越高，其遺傳背景越復(fù)雜，這符合楸樹作為一種分布廣泛、異交率高、生命周期長的木本植物[20-21]，具備物種遺傳多樣性較高特點(diǎn)的觀點(diǎn)[22-23]。

圖5 44份楸樹種質(zhì)材料的AFLP 聚類圖像Fig.5 Dendrogram of 44 accessions of Catalpa bungei germplasm with AFLP markers

楸樹組植物分類系統(tǒng)提出于20 世紀(jì)90年代[7]，一直沿用至今，目前基于簡單的形態(tài)表型標(biāo)記已不能準(zhǔn)確對楸樹資源進(jìn)行有效的分類，且至今還沒有統(tǒng)一分類的方法。本研究中，8 對引物組合共擴(kuò)增出特異性條帶261 條，這些特異性條帶可快速準(zhǔn)確的對供試材料進(jìn)行鑒別，比簡單通過表型性狀進(jìn)行分類更為可靠，對楸樹親緣關(guān)系的劃分更有意義。同時，由遺傳相似性系數(shù)可知，44份楸樹種質(zhì)遺傳相似性系數(shù)平均值為0.652 7，其中山東萊陽的c5 號和河南洛陽市洛寧縣地區(qū)的c34 號資源遺傳相似系數(shù)最小，為0.502 2，說明這兩個種質(zhì)的遺傳分化差異較大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；來源山東蒙陰的c6 號和c7 號種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)最大，為0.791 9，說明遺傳分化差異最小，親緣關(guān)系最近。但通過聚類分析（圖5）得出，在遺傳相似系數(shù)0.65 處44份楸樹種質(zhì)材料劃分為5組，而部分來源于同一地區(qū)的種質(zhì)并沒有完全聚為1 類。其中第1 組與第2 組均出現(xiàn)了山東、河南不同省份種質(zhì)聚為一組的現(xiàn)象，在第1 組、第2組與第3 組也伴隨出現(xiàn)了同一省份不同地區(qū)種質(zhì)聚為一組的現(xiàn)象。同時，第1 組與第3 組的c44、c39、c40號栽培品種（良種）與野生資源也聚為1類，這些地區(qū)的栽培種和野種之間存在大量的本地基因流。綜上，魯豫地區(qū)楸樹資源的遺傳多樣性以及親緣關(guān)系與地理分布間無明顯相關(guān)性，造成這一問題的原因較多，一方面是楸樹組分類繁多，起源和親緣關(guān)系較為復(fù)雜，存在屬內(nèi)各種變異所致；另一方面與山東、河南相毗鄰，地域范圍較近，楸樹種源間存在相互引種、基因交流比較頻繁有關(guān)；再一方面也可能與同一區(qū)域資源收集時栽培品種與野生種質(zhì)混淆有關(guān)[24-27]。

楸樹作為優(yōu)良的珍貴鄉(xiāng)土樹種，已被列入重要樹種保存收集名錄，而位于黃準(zhǔn)海平原丘陵楸樹栽培區(qū)的魯豫地區(qū)，是楸樹種質(zhì)資源的適宜分布區(qū)，其資源的種類和數(shù)量繁多。而本研究所收集的楸樹種質(zhì)資源僅涉及魯豫8 個縣市地區(qū)44 個優(yōu)良單株，其中河南僅3 個地區(qū)11 個單株，收集范圍相對集中，難以代表兩省楸樹資源的全部遺傳背景。因此，研究結(jié)果在范圍上具有一定局限性，今后需根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，明確資源分布現(xiàn)狀，以擴(kuò)大楸樹種質(zhì)資源的收集范圍。同時，在借助分子標(biāo)記技術(shù)的同時，還應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)等其它鑒定方法，才能更加全面、準(zhǔn)確的反映楸樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性。