尹澤超，王玉婷，王耀杰，桑利群，羅秋香，孟凡娟

（1.東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.西藏自治區(qū)林木科學研究院，西藏 拉薩 850000；3.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000）

西藏巨柏Cupressus giganteaW.C.Cheng et L.K.Fu 為柏科Cupressaceae 柏木屬Cupressus植物，主要分布于雅魯藏布江朗縣至米林附近的沿江地段，呈零星分布，是西藏特有的古樹，又稱“雅魯藏布江柏木”，壽命可達千年[1]。同時也是較為典型的西藏“孑遺植物”，已經在《國家重點保護野生植物名錄》中被列為國家Ⅰ級保護植物[2]。此外，西藏巨柏一直以來被用于制作藏香，在藏傳佛教的宗教活動中發(fā)揮著重要作用，同時巨柏具有耐干旱、耐瘠薄等特征，針對巨柏這些特點開展研究具有較高文化價值和生態(tài)價值[3-4]。

但是，由于西藏植物生長在獨特的地理環(huán)境條件，針對西藏植物開展的深入研究還較少[5]。因此，本研究利用巨柏為研究材料，對于植物生態(tài)學和進化生物學研究具有較高生態(tài)價值和科學價值。由于生長環(huán)境特殊，有關西藏巨柏的研究報道還較少，其蛋白組學方面的研究則更少。蛋白質組學（proteomics）是以蛋白質組為研究對象，可以從整體水平研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規(guī)律的科學[6-7]。但是，由于蛋白質雙向電泳技術受植物材料本身因素的影響較大，本試驗中的研究材料巨柏葉片中含有多種次生代謝物質以及精油組分，在很大程度上影響了葉片蛋白的提取[3]。因此，本試驗采取3 種葉片總蛋白質提取方法，同時進行了一些細節(jié)的優(yōu)化，以篩選出一種可獲得高質量西藏巨柏葉片總蛋白的提取方法，并建立了適合于西藏巨柏葉片蛋白質組分析的蛋白雙向電泳技術體系，從而為從蛋白組水平研究西藏巨柏奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及藥品使用

將西藏巨柏種子播種于蛭石和土（1 ∶3）混合的土壤中，待葉片生長至30 d 左右進行葉片總蛋白的提取。其中主要使用三氯乙酸，丙酮，醋酸銨，蛋白酶抑制劑，Tris 飽和酚和水飽和酚等化學藥品，且皆為化學純。

1.2 提取方法

1.2.1 酚抽提法

取3 g 巨柏葉片放入研缽中，加入少量液氮，充分研磨；研磨至細小粉末狀時，加入Tris 飽和酚和抽提液，用清潔后的藥勺轉移至50 mL 離心管中；用漩渦震蕩器充分震蕩，每震蕩1 min 冰上冷卻1 min，直到離心管中的固體粉末變?yōu)橐后w即可；在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心20 min，將上層酚相轉移至新離心管中，放置在冰上；向下層水相中加入抽提液和Tris 飽和酚，使用漩渦震蕩器震蕩30 min，每震蕩1 min 冰上冷卻1 min，使蛋白質得到充分提??；于4 ℃，10 000 r/min 離心20 min，將酚相轉移至新50 mL 離心管中；兩次所得酚相合并，加入酚相5 倍體積的醋酸銨甲醇于酚相中，震蕩30 s，放置在-20 ℃冰箱中沉淀1 h 或者沉淀過夜；于4 ℃，10 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入醋酸銨甲醇，將沉淀沿著管壁分散開，充分混勻，-20 ℃沉淀15 min，重復3 遍；于4℃，10 000 r/min 離心15 min，加入80%丙酮溶液，將沉淀沿著管壁分散開，充分混勻，-20 ℃沉淀15 min；加入100%丙酮溶液，吸打沉淀并充分混勻，-20 ℃沉淀15 min，重復3 遍；晾干，使沉淀干燥，保存于-80℃后備用。當電泳時，加入蛋白樣品10 倍體積的裂解液,室溫裂解1 h；于4℃，13 000 r/min 離心0.5 h，將上清轉移至1.5 mL 離心管中，上清液即為蛋白樣品。

1.2.2 TCA/丙酮法

取3 g 西藏巨柏葉片放入研缽中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及液氮進行充分研磨；研磨至細小粉末狀后分裝于5 mL 離心管；加入10%TCA 丙酮于離心管中，充分混勻，再放入-20 ℃冰箱中過夜；然后于4 ℃、13 000 r/min 離心20 min；棄去上清液，加入80%丙酮溶液洗滌沉淀；-20℃反應20 min，4℃、13 000 r/min 離心20 min；棄去上清液，加入100%丙酮混勻，-20 ℃反應20 min。再于4℃、13 000 r/min 離心20 min；用100%丙酮重復洗滌直到沉淀為白色，最后棄去上清液，使用凍干機凍對沉淀進行干燥后按0.1 克加1 mL 的比例加入水飽和酚，再加入1 μL0.1 mol 的DTT，漩渦震蕩混勻，至于冰上放置1 h，期間不時震蕩；4 ℃，13 000 r/m 離心30 min，吸取上清液，并加入3 倍體積的醋酸銨甲醇和1 μL0.1 mol 的DTT，放置于-20 ℃過夜；重復加入飽和酚提取蛋白的過程，將最終加入醋酸銨甲醇的試管放置于-20 ℃；之后4 ℃、13 500 r/min 離心5 min,棄去上清液；加80%丙酮并用剪過的槍頭吸打，-20 ℃反應20 min；然后于4 ℃、13 500 r/min 離心5 min，棄去上清液；加入100%丙酮，并用剪過的槍頭吸打，-20 ℃反應20 min；然后于4 ℃、13 500 r/min 離心5 min，棄去上清液；晾干，使沉淀干燥，將沉淀保存于-80 ℃?zhèn)溆?。電泳應用蛋白時，方法同上。

1.2.3 TCA/丙酮優(yōu)化法

對TCA/丙酮法進行細節(jié)優(yōu)化，對具體步驟進行如下調整：樣品在用TCA 丙酮處理后，增加丙酮的清洗次數(shù)，在清洗過程中，使用剪過的槍頭，清洗直到粗蛋白粉末可以在丙酮清洗液中自然沉降為止；在醋酸銨甲醇清洗蛋白質樣品的過程中，增加2 次使用醋酸銨甲醇清洗的步驟，并且適當增加用丙酮清洗的次數(shù)，直到蛋白樣品可以在清洗液中自然沉降；同時延長蛋白質樣品在空氣中晾干的時間，保證沒有丙酮殘留；在裂解液中添加蛋白酶抑制劑，并且在超聲的環(huán)境下進行裂解；與水化液混合后，于4 ℃，13 000 r/min離心30 min，吸取樣品時注意不要吸出沉淀物。

1.3 蛋白定量及一向電泳

采用2-D Quant Kit 試劑盒進行蛋白定量的分析測定。每個樣品重復測定3 次，取平均值。分別配置分離膠和濃縮膠，在膠孔中加入蛋白樣品，根據(jù)蛋白質濃度確定上樣體積，不夠30 μL 的加入蛋白Buffer 補足，用SDS 緩沖液覆蓋已經上樣的膠孔，注意不要產生氣泡或者把蛋白樣品溢出，補充SDS緩沖液至液面完全覆蓋膠孔，蓋上膠條槽蓋子，連接電泳儀，恒壓80 V 進行3 h。染色等具體方法參考曹原等[6]。用掃描儀進行掃膠，把圖片保存為 TIF 格式。掃描完成后對掃描圖片進行分析。

1.4 等電聚焦

在膠條槽中加入蛋白質樣品，根據(jù)蛋白質濃度確定上樣體積，不夠250 μL 的加入水化液補足，將13cm，pH 值為4.0～7.0 的膠條放入膠條槽，注意不要產生氣泡，蓋上膠條槽蓋子，置于一向電泳儀（Ettan IP Gphor Ⅱ），等電聚焦程序見表1。

表1 等點聚焦程序Table1 Equal point focusing procedure

第二向SDS-PAGE 的步驟和染色等具體方法參考曹原等[8]，并加以改良。用掃描儀進行掃膠，把圖片保存為 TIF 格式進行后期比對分析。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對蛋白濃度的影響

由表2可以看出：采用TCA/丙酮法提取的蛋白質濃度高于采用酚抽提法TCA/丙酮法改良法，對TCA-丙酮法進行細節(jié)優(yōu)化后蛋白的濃度雖然有些下降，但卻在很大程度上提高了蛋白的純度，可能方法二提取的蛋白含有一些可以影響蛋白的濃度的雜質。

表2 不同方法提取的蛋白濃度Table2 Concentrations of proteins extracted by different methods

2.2 不同提取方法對蛋白雙向圖譜的影響

圖1為利用3 種不同提取方法對西藏巨柏葉片總蛋白的一向凝膠電泳掃描圖。從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)：采用酚抽提法提取的蛋白圖譜中，有較多蛋白條帶丟失，同時由于丙酮清洗的次數(shù)較少，也導致了在大于38 kDa 的蛋白條帶清晰度不夠；而使用TCA 丙酮法提取的蛋白，蛋白條帶數(shù)有明顯增加趨勢，但是大于38 kDa 的蛋白條帶不夠清晰的問題依舊存在；針對蛋白條帶不夠清晰的問題，利用TCA/丙酮法并進行了進一步的優(yōu)化，主要通過增加丙酮清洗次數(shù)，利用超聲清除殘留核酸，通過高速離心沉淀大部分雜質等方法，從而很大程度上提高了蛋白的純度，在圖譜中也可以看到蛋白條帶表現(xiàn)清晰。

圖1 3 種方法提取蛋白質的一向凝膠電泳掃描圖像Fig.1 Continuous gel electrophoresis scanning of proteins by three methods

本試驗采取了3 種提取方法分別提取西藏巨柏葉片的總蛋白，比較了3 種不同提取方法的試驗結果，同時對雙向電泳圖譜的影響進行了對比分析（見圖2）。通過對比3 張凝膠掃描圖，我們可以發(fā)現(xiàn)：采用酚抽提法提取的雙向電泳圖顯示有較多的小分子蛋白出現(xiàn)遺失，尤其是堿性端丟失現(xiàn)象比較嚴重，而且由于丙酮清洗次數(shù)較少，圖譜中出現(xiàn)明顯的橫帶條紋（圖2a）。而使用TCA 丙酮法提取的蛋白雙向電泳圖顯示：蛋白點數(shù)量明顯增多，但依舊存在較多橫紋以及豎紋，尤其是凝膠上部的一些連續(xù)的蛋白點分離效果較差（圖2b）。采用TCA/丙酮優(yōu)化法，針對出現(xiàn)較多橫豎條紋的現(xiàn)象有所改善，這主要是由于增加了清洗次數(shù)，并通過超聲清去除了蛋白樣品中的核酸成分，并在上樣前，通過高速離心的方法，將大部分雜質沉淀在底部而不吸出，從而很大程度上提高了蛋白樣品純度，因此雙向電泳圖譜中的蛋白點清晰可見，且分布均勻（圖2c）。

3 結論與討論

高質量蛋白質的提取是蛋白質雙向電泳能否成功的關鍵環(huán)節(jié)，為了獲得高質量的葉片蛋白質，不僅需要在提取過程中減少蛋白樣品的損失，還要保證樣品的純度[8]。因此，為了保證蛋白樣品的濃度和純度，應該考慮多種因素，首先，對西藏巨柏葉片進行充分研磨是首要的關鍵步驟，同時使用優(yōu)質的藥品對蛋白進行充分溶解也是必要的環(huán)節(jié)。此外，在蛋白提取過程中，應避免使用那些可以對蛋白造成過多降解的藥品（如：β-巰基乙醇、DTT、蛋白酶抑制劑等）[9-10]。

圖2 3 種方法提取蛋白的雙向電泳圖譜Fig.2 Two-dimensional electrophoresis maps of proteins extracted by three methods

由于西藏巨柏葉片中含有大量對蛋白提取造成影響的物質，這是導致西藏巨柏葉片高質量蛋白質困難的直接因素，這一問題如果不能解決，將會對后期蛋白雙向電泳擴增產生較大影響，例如會導致：蛋白點分離效果差；較多橫豎條紋出現(xiàn)；分辨率降低；膠板背景脫色不徹底等問題的出現(xiàn)。因此在本研究中，針對蛋白提取過程中的細節(jié)問題進行了優(yōu)化，從而在雙向電泳圖譜中蛋白點的數(shù)量以及分辨率方面有了明顯的改善。

通過對比不同方法獲得的蛋白圖譜，可以發(fā)現(xiàn)：與方法3 相比，采用方法一和方法二會導致電泳圖譜出現(xiàn)嚴重的拖尾現(xiàn)象，且方法一提取的蛋白點有較大的損失，同時蛋白點的分離效果也較差，而且不規(guī)則的形狀嚴重影響了之后的對比分析。而采用方法3 通過增加提純步驟，所獲得的蛋白質濃度較高，凝膠上的蛋白點數(shù)目也有所增加，而且不同蛋白點之間分離較為徹底，同時蛋白點形狀更接近較為規(guī)則的圓形，較利于后期的分析比對。

在對黃瓜根系[7]、光核桃葉片[5]等葉片的蛋白質提取條件優(yōu)化的結果也顯示：TCA-丙酮法提取的蛋白質量優(yōu)于酚抽提法。而王新芳等對大豆進行總蛋白雙向電泳條件優(yōu)化的試驗結果表明，酚抽提法提取的蛋白質量要優(yōu)于TCA-丙酮法[6，11]。這些不同方法對不同植物材料的適用性，可能是因為不同植物組織含有的成分不同。因此，要獲得不同植物的優(yōu)質蛋白，需要根據(jù)植物自身因素來確定。同時，綜合這些方法也發(fā)現(xiàn)：優(yōu)化一些操作細節(jié)操作，同時使用一些優(yōu)質的藥品對實驗的結果有很大幫助。本試驗在TCA/丙酮法的基礎上進行了細節(jié)優(yōu)化處理，可以有效的抑制蛋白酶活性，同時去除糖類、鹽類等雜質的干擾，從而獲得了高質量的西藏巨柏葉片的總蛋白樣品以及蛋白點清晰的蛋白質圖譜，也為后期的對比分析工作奠定了良好的基礎。

本研究只通過3 種方法對巨柏葉片的總蛋白圖譜進行了比較，確定了適合巨柏蛋白的提取方法，并獲取到了高質量的巨柏蛋白樣品，為今后針對該物種進化對環(huán)境適應機理方面的深入研究奠定了基礎。

采用TCA/丙酮優(yōu)化法，同時注意操作細節(jié)，可以獲得高質量的西藏巨柏葉片總蛋白樣品，為后續(xù)有關西藏巨柏的蛋白組質組學研究奠定了基礎。