呂 飛 田書芳

湖北省十堰市人民醫(yī)院消化內科1(442000) 中醫(yī)科2

重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是以胰腺彌漫性出血和組織壞死為特征，由多種病因導致胰酶在胰腺內被激活后累及全身多個臟器的危重疾病，病死率一般>10%[1-2]。SAP的發(fā)病機制目前尚未完全明確，可能與氧化應激、內質網(wǎng)應激等多種因素有關。現(xiàn)有研究認為，在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨大量炎性介質的釋放，其炎癥程度與腺泡細胞凋亡呈負相關。超氧化物歧化酶(SOD)是體內重要的氧自由基清除劑，清除自由基和調節(jié)細胞凋亡是SAP的有效治療靶點之一。PEP-1-SOD1是一種利用基因工程技術合成的融合蛋白，具有高度的穩(wěn)定性，能攜帶多種肽段和蛋白質以天然活性形式進入細胞，該過程無需任何化學共價結合或變性步驟，具有較好的安全性[3]。有研究證實PEP-1-SOD1可轉導進入缺血/再灌注損傷后大鼠的大腦皮質并發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用[4]，但對SAP的作用尚未見相關報道。本研究通過觀察PEP-1-SOD1對SAP大鼠細胞凋亡的影響，旨在為探討PEP-1-SOD1的作用機制提供參考。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑

24只雄性Wistar大鼠購自北京聯(lián)通利華生物技術有限公司[許可證編號：SCXK(京)2016-0001]，體質量22～24 g，10周齡。血清淀粉酶和脂肪酶檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司，caspase-3單克隆抗體和內參β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司(工作濃度1∶500)，二抗購自美國Abcam公司(工作濃度1∶2 500)。Trizol試劑購自美國Invitrogen 公司，PCR試劑盒購自美國Life Technologies公司。?；悄懰徕c購自北京奧博星生物技術責任有限公司。

二、研究方法

1. 動物分組、模型建立和處理：將所有大鼠隨機分為對照組、SAP組和實驗組，每組各8只。SAP動物模型的建立參照郭婉薇等[2]的方法。使用一次性靜脈留置套管針對系膜緣的腸壁進行穿刺，逆行插入膽胰管，阻斷膽總管后，勻速注射5%?；悄懰徕c(1 mL/kg)，注射速率為0.1 mL/min。注射完畢5 min后拔管，回納十二指腸后關腹。實驗組在造模前30 min腹部皮下注射8.0 mg/kg PEP-1-SOD1(美國BD公司)。SAP組大鼠注射同劑量的0.9% NaCl溶液。對照組常規(guī)進行飼養(yǎng)管理。

將所有大鼠麻醉后心臟采血，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，-20 ℃凍存?zhèn)錅y。取血后處死大鼠，取病變較為一致的胰頭部組織，置于4%甲醛溶液中固定，4 μm厚連續(xù)切片，行后續(xù)檢測。

2. TUNEL法檢測胰腺腺泡細胞凋亡：選擇三組大鼠病理切片，二甲苯脫蠟后，加入TUNEL反應液與轉化劑-POD，DAB顯色，光學顯微鏡下觀察并計數(shù)，計算凋亡指數(shù)。

3. 血清脂肪酶、淀粉酶的測定：術后24 h，采用全自動生化分析儀檢測血清脂肪酶、淀粉酶水平。

4. 胰腺組織病理學評分：胰腺組織標本行HE染色，在光學顯微鏡下由病理科醫(yī)師行雙盲評分。0分：胰腺組織清晰，無炎癥；2分：胰腺炎癥區(qū)域所占比例≤5%；4分：6%～25%；6分：26%～50%；8分：51%～75%；10分：>75%。

5. 熒光定量PCR法檢測caspase-3 mRNA表達：采用Trizol一步法提取胰腺組織總RNA，并反轉錄為cDNA，行熒光定量PCR。擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游：5’-CGG GTG TCA GGA ATC AAA TC-3’，下游：5’-TGG AAG GTC TCG CAA ATA CTG-3’，片段長度275 bp。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。采用2-ΔΔCt法檢測caspase-3 mRNA表達水平。

6. 蛋白質印跡法檢測caspase-3蛋白表達：具體步驟按試劑盒說明書進行操作。以β-actin作為內參，蛋白表達量=各處理組蛋白條帶的光密度值/內參蛋白條帶的光密度值。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、脂肪酶、淀粉酶水平比較

造模后24 h，SAP組和實驗組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平較對照組均顯著升高(P<0.05)，而實驗組顯著低于SAP組(P<0.05)(表1)。

二、組織病理學評分比較

實驗組大鼠胰腺小葉間隙增寬，可見中性粒細胞和單核細胞浸潤，但小葉結構相對完好；SAP組大鼠胰腺組織結構破壞明顯，小葉排列紊亂，局部血管壁出血、壞死；對照組未見明顯異常(圖1)。

表1 三組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平比較

*與對照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

A：對照組；B：SAP組；C：實驗組

造模后6 h、24 h，SAP組和實驗組大鼠胰腺組織病理學評分均顯著高于對照組(P<0.05)，而實驗組顯著低于SAP組(P<0.05)(表2)。

三、細胞凋亡情況

造模后6 h、24 h，實驗組和SAP組胰腺細胞凋亡指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，而實驗組顯著高于SAP組(P<0.05)(表3)。

四、caspase-3表達情況

造模后24 h，實驗組和SAP組胰腺組織caspase-3 mRNA和蛋白表達均顯著高于對照組(P<0.05)，而實驗組顯著高于SAP組(P<0.05)(表4、圖2)。

表2 三組大鼠胰腺組織病理學評分比較

*與對照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

表3 三組大鼠胰腺細胞凋亡指數(shù)比較

*與對照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

表4 三組大鼠胰腺組織caspase-3 mRNA和蛋白表達比較

*與對照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

1 Da=0.992 1 u

SAP是常見急腹癥之一，具體的發(fā)病機制尚不明確。相關研究認為，發(fā)生SAP時，在損傷因子作用下，單核細胞被激活并釋放多種細胞因子，導致全身炎癥反應綜合征，嚴重情況下患者可出現(xiàn)多器官功能不全甚至死亡[5-6]。SAP的診治已成為目前的研究熱點。PEP-1是人工合成的細胞穿透肽，包含一個三肽SQP組成的連接序列、一個富含賴氨酸的親水性序列(KKKRKV)和一個富含色氨酸的疏水性序列(KETWWETWWTEW)。PEP-1可介導細菌胞外酶、過氧化氫酶、綠色熒光蛋白、核糖體蛋白以天然活性形式轉導進入離體或在體的細胞中，從而有效發(fā)揮生物學效應[7]。SOD1主要存在于真核細胞的胞質內，可有效清除氧自由基，使細胞免受氧化損傷。有研究表明PEP-1與SOD1融合后，可使后者的半衰期延長，穩(wěn)定性提高[8]。本研究顯示造模后24 h，SAP組和實驗組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平較對照組均顯著升高(P<0.05)，而實驗組顯著低于SAP組(P<0.05)；造模后6 h、24 h，SAP組和實驗組胰腺組織病理學評分均顯著高于對照組(P<0.05)，而實驗組顯著低于SAP組(P<0.05)。說明PEP-1-SOD1能緩解SAP病情，減輕大鼠胰腺組織的病理損害。

細胞凋亡是受眾多凋亡相關基因調控的程序性細胞死亡，胰腺腺泡細胞凋亡可保護腺泡細胞損傷，并可減輕SAP病情[9]。腺泡細胞死亡是SAP炎癥過程中的重要病理特征，腺泡細胞的壞死和凋亡共同存在于SAP的不同病理類型中[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后6 h、24 h，實驗組胰腺細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組和SAP組(P<0.05)。誘導胰腺腺泡細胞的凋亡可能在一定程度上減輕SAP的病情[11]。PEP-1-SOD1作為有機體重要的氧自由基清除劑，可促進細胞凋亡，從而有利于保護胰腺組織的功能。有研究[4]表明PEP-1-SOD1預處理可使SOD1活性維持在較高水平，從而提高清除氧自由基的能力，從另一方面反映了其對胰腺組織的保護效應。

現(xiàn)有研究表明，在SAP起病初期，如胰腺腺泡細胞出現(xiàn)大量壞死，可觸發(fā)級聯(lián)放大反應，從而導致嚴重的預后[12]。細胞內存在多條細胞凋亡信號通路，caspases是細胞凋亡過程的主要執(zhí)行者，活化的caspase-3可經(jīng)蛋白酶解過程激活后，最終引發(fā)細胞凋亡[13]。Caspase-3介導了急性胰腺炎腺泡細胞凋亡，caspase-3表達缺失可明顯加重大鼠SAP病情[14]。本研究中，造模后24 h，SAP組大鼠胰腺組織caspase-3 mRNA和蛋白表達顯著高于對照組，但顯著低于實驗組(P<0.05)。表明PEP-1-SOD1能調節(jié)caspase-3表達水平，從而影響胰腺細胞的凋亡。

總之，PEP-1-SOD1可通過調控SAP大鼠細胞凋亡相關基因caspase-3的表達，減輕胰腺組織病理損害，增加胰腺腺泡細胞凋亡，促進胰腺功能恢復正常。但具體的機制仍需進一步研究探討。