范俊杰 曾 悅 黃春蘭 陸穎影

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(201620)

肥胖是一個(gè)全球性流行性疾病，是呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病、2型糖尿病以及腫瘤的高危因素[1-2]。近年研究表明，腸道菌群在調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及誘發(fā)肥胖中起有關(guān)鍵作用[3-4]，而無(wú)菌小鼠可抵抗高脂飲食誘發(fā)的肥胖和代謝紊亂[5]。

腸上皮細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)代謝、維持腸道屏障功能、產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子等至關(guān)重要[6-9]。研究顯示組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase 3, HDAC3)通過(guò)行使去乙酰化功能調(diào)控腸上皮細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞與細(xì)菌或其代謝產(chǎn)物之間的相互作用，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[10-11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸對(duì)HDAC活性具有抑制作用[12-15]，敲除腸上皮細(xì)胞的HDAC3或給予丁酸鹽可防止小鼠由高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖[15]。本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，初步探討末端回腸HDAC3表達(dá)與肥胖的關(guān)系，以及腸道菌群的存在是否會(huì)影響HDAC3表達(dá)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

SPF C57BL/6小鼠和無(wú)菌C57BL/6小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、無(wú)菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法》(GB/T 14926.41-2001)，無(wú)菌小鼠飼養(yǎng)于無(wú)菌隔離器中，飼料、飲水、空氣供給均在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，飼料經(jīng)40 kGy Co-60輻照消毒。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料、飲水、墊料、鼠籠、飲水瓶等均采用高溫高壓滅菌(121 ℃, 60 min)。環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，光照周期明暗比12 h∶12 h。每周對(duì)小鼠糞便行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，細(xì)菌16S DNA V3區(qū)引物PCR擴(kuò)增陰性[16]。

兔抗人HDAC3單克隆抗體(Abcam plc.)；免疫組化SP檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；TRIzolTM試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)[寶生物工程(大連)有限公司]；SYBRTMGreen Real-Time PCR Master Mixes(Applied Bio-systemsTM, Thermo Fisher Scientific)；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組：8只6周齡SPF C57BL/6小鼠(SPF組)和8只6周齡無(wú)菌C57BL/6小鼠(無(wú)菌組)分別隨機(jī)分為普通飲食組和高脂飲食組，每組4只，相應(yīng)喂飼普通飼料和高脂飼料，共5周。高脂飼料配方：干酪素195 g/kg，DL-蛋氨酸3 g/kg，玉米粉130 g/kg，麥芽糊精140 g/kg，蔗糖255 g/kg，無(wú)水乳脂180 g/kg，纖維素45 g/kg，礦物質(zhì)混合物35 g/kg，維生素混合物10 g/kg，膽堿酒石酸鹽1 g/kg，抗氧化劑0.004 g/kg。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝食、飲水，每周稱重，記錄體質(zhì)量變化。

2. 標(biāo)本獲?。河柘鄳?yīng)飼料喂養(yǎng)5周后，實(shí)驗(yàn)小鼠以CO2麻醉處死，經(jīng)腹部切口打開(kāi)腹腔，循盲腸找到回腸末端，切取3～5 cm末端回腸組織，4%甲醛或液氮保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. 免疫組化染色：小鼠末端回腸組織4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，脫蠟，3% H2O2室溫孵育30 min，熱修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉；加入一抗兔抗人HDAC3單克隆抗體，濕盒4 ℃過(guò)夜，次日加入鼠抗兔二抗，濕盒37 ℃ 30 min，DAB顯色，常規(guī)乙醇梯度脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。HDAC3免疫陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞質(zhì)。Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化圖像，計(jì)算積分光密度值(IOD值)。

4. Real-time PCR：以TRIzol試劑抽提末端回腸組織總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度，定量至500 ng/μL。使用反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，使用StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)行PCR擴(kuò)增。引物序列：GAPDH(內(nèi)參)F 5’-CAA AAG GGT CAT CAT CTC C-3’, R 5’-CCC CAG CAT CAA AGG TG-3’; HDAC3 F 5’-TGC ACC CAG TGT CCA GAT TC-3’, R 5’-TTT CAG AGA GCC ACG CCT TC-3’。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，SYBR?Green 10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、小鼠體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組小鼠熱量消耗和體質(zhì)量變化見(jiàn)圖1。與SPF普通飲食組相比，SPF高脂飲食組小鼠體質(zhì)量從第1周起即明顯增長(zhǎng)，各時(shí)點(diǎn)兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)菌高脂飲食組、無(wú)菌普通飲食組和SPF普通飲食組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體質(zhì)量無(wú)明顯變化(P>0.05)。

二、小鼠末端回腸HDAC3表達(dá)

1. HDAC3蛋白表達(dá)：免疫組化染色顯示，HDAC3蛋白表達(dá)主要定位于小鼠末端回腸腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞質(zhì)。SPF高脂飲食組HDAC3蛋白表達(dá)明顯高于SPF普通飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)菌高脂飲食組與無(wú)菌普通飲食組間HDAC3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖2)。

2. HDAC3 mRNA表達(dá)：real-time PCR檢測(cè)顯示，SPF高脂飲食組末端回腸組織HDAC3 mRNA表達(dá)明顯高于SPF普通飲食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)菌高脂飲食組與無(wú)菌普通飲食組間HDAC3 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖3)。

討 論

近年來(lái)關(guān)于肥胖的研究日益增多，現(xiàn)已證實(shí)肥胖與多個(gè)器官系統(tǒng)的疾病密切相關(guān)。表達(dá)于肝臟、肌肉和脂肪組織中的HDAC3與脂肪代謝密切相關(guān)[17-21]；而腸上皮細(xì)胞中的HDAC3可通過(guò)整合腸道菌群誘導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)宿主與菌群之間的相互作用，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[10-11]。 將腸上皮細(xì)胞特異性HDAC3缺失小鼠誘導(dǎo)為無(wú)菌狀態(tài)，其在常規(guī)飼養(yǎng)時(shí)所呈現(xiàn)的Paneth細(xì)胞消失、腸上皮功能受損、基因表達(dá)失調(diào)均獲明顯改善[10]。研究[15]報(bào)道小鼠末端回腸上皮HDAC3能促進(jìn)由高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，條件性敲除腸上皮細(xì)胞中的HDAC3后，肥胖小鼠體質(zhì)量顯著減輕，代謝譜亦有所改善；該研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌代謝產(chǎn)物丁酸鹽對(duì)HDAC3活性具有抑制作用。因此，本研究利用無(wú)菌小鼠初步探討腸道HDAC3與肥胖的關(guān)系，以及腸道菌群對(duì)HDAC3表達(dá)的影響。

分別予SFP小鼠和無(wú)菌小鼠普通飲食和高脂飲食，結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng)5周的SPF小鼠體質(zhì)量明顯增加，末端回腸HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)亦顯著上調(diào)，證實(shí)了HDAC3在末端回腸的表達(dá)與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖之間的相關(guān)性。Lundh等[22]發(fā)現(xiàn)抑制HDAC3可改善2型糖尿病大鼠模型的高血糖，增加胰島素分泌。Sun等[23]的研究則顯示HDAC3通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，對(duì)維持心肌線粒體功能具有重要作用，在心肌和骨骼肌HDAC3基因敲除小鼠中，高脂飲食可誘導(dǎo)嚴(yán)重肥厚型心肌病并致死。在肝臟中，HDAC3可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的晝夜節(jié)律[17]。肝臟中高表達(dá)的HDAC3可通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)和肝臟X受體-α(LXR-α)信號(hào)途徑參與促進(jìn)高脂飲食引起的代謝綜合征[24]；或通過(guò)下調(diào)肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α(Cpt1α)導(dǎo)致肝臟脂肪變性和和肝損傷[25]。而丁酸鹽可通過(guò)抑制HDAC3刺激肝臟成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化和酮體生成[26]。HDAC3表達(dá)對(duì)能量代謝和體質(zhì)量發(fā)揮何種作用取決于其靶基因，其在肝臟和脂肪組織中的一些靶基因已得到鑒定，在腸上皮細(xì)胞中的靶基因包括參與腸道菌群相關(guān)代謝調(diào)節(jié)的Chka、Mttp、Apoa1、Pck1等[15]。需對(duì)HDAC3在特定細(xì)胞和特定環(huán)境中的作用作進(jìn)一步研究。

**與同組0周比較，P<0.01

A：低倍鏡下末端回腸組織HDAC3蛋白表達(dá)(免疫組化SP法，×100)；B：HDAC3蛋白相對(duì)表達(dá)量(**兩組間比較，P<0.01)

圖2 各組小鼠喂養(yǎng)5周后末端回腸組織HDAC3蛋白表達(dá)比較

**兩組間比較，P<0.01

腸上皮細(xì)胞中的HDAC3表達(dá)與一些腸道微生物相關(guān)，既往研究證實(shí)了HDAC3與腸道菌群之間的聯(lián)系。Yuille等[27]發(fā)現(xiàn)除丁酸外，人類(lèi)腸道菌群還可通過(guò)產(chǎn)生戊酸抑制HDAC表達(dá)。動(dòng)物和人體研究均表明在出生早期使用抗菌藥物可能改變腸道菌群組分，進(jìn)而影響機(jī)體代謝功能，誘導(dǎo)肥胖發(fā)生[28-30]，推測(cè)抗菌藥物引起的腸道菌群改變對(duì)HDAC3表達(dá)的影響參與了肥胖的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)菌高脂飲食小鼠末端回腸HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)與無(wú)菌普通飲食小鼠相比無(wú)明顯改變，亦不發(fā)生肥胖，同樣提示了腸道菌群在HDAC3參與肥胖發(fā)生中對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，與上述推測(cè)相符。

綜上所述，本研究初步探討了末端回腸HDAC3表達(dá)與肥胖以及腸道菌群的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)末端回腸HDAC3表達(dá)可能具有潛在調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而參與肥胖發(fā)生，為肥胖的預(yù)防和治療策略提供了新的思路。后續(xù)研究擬通過(guò)高通量測(cè)序等方法篩選出影響腸道HDAC3表達(dá)的目標(biāo)菌群，并闡明其與肥胖之間的關(guān)系，從而進(jìn)一步明確HDAC3、腸道菌群、肥胖這三者間的聯(lián)系。