高潔 趙銘昕 劉恩華

摘要：狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）依賴宿主細胞完成其感染周期，且在胞漿內(nèi)復制。微管作為一種細胞骨架，是介導胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)闹匾ǖ?。為探究狂犬病病毒胞?nèi)感染是否依賴于細胞骨架——微管，利用小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞（N2a），接種實驗室標準攻擊毒株CVS-11，通過諾考達唑（Nocodazole）抑制劑破壞微管形成，采用實時熒光定量PCR方法、Western Blot方法、免疫熒光方法檢測微管對于RABV感染量的影響，并采用TCID50法測定微管對RABV病毒滴度的影響。結(jié)果表明，Nocodazole通過抑制微管的形成，使RABV N基因水平降低25%、N蛋白水平降低50%，免疫熒光檢測到病毒感染率降低70%，上清液中病毒滴度由106.5TCID50/mL降低至104.5TCID50/mL，說明狂犬病病毒胞內(nèi)感染依賴于細胞骨架-微管的參與。該結(jié)果為進一步研究狂犬病病毒胞內(nèi)運輸及其復制機制的研究提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：狂犬病病毒;微管;諾考達唑;胞內(nèi)感染

中圖分類號：S851? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）10-0121-04

Abstract： Rabies virus （RABV） is entirely accomplished its infection in cells cytoplasmic. Cytoskeletal microtubules mediates cargoes to move throughout the cytoplasm. In this study， we investigated the modulatory effect of a microtubule-inhibitor， Nocodazole， on RABV infection in mouse Neuro-2a cells （N2a）. The N2a cells viability was analyzed by MTT. In cells treated with Nocodazole， then infected with laboratory challenge virus standard CVS-11. mRNA level and protein level of RABV were respectively reduced about 25% and 50% by real-time PCR and Western Blot. Significantly， viral infection rate was obviously decent 70% by immunofluorescence and the virus titer was decreased from 106.5TCID50/mL to 104.5TCID50/mL. These results indicated that RABV undergo intracellular transport mediated by cytoskeleton-microtubule. These results provide a theoretical basis for further study on the intracellular trafficking of RABV and its replication mechanism.

Key words： rabies virus; microtubule; Nocodazole; intracellular infection

狂犬病是由狂犬病毒屬彈狀病毒科的狂犬病病毒（RABV）引起神經(jīng)系統(tǒng)障礙的一種高度致死性人獸共患傳染病。其感染譜廣，流行地區(qū)幾乎遍及全球，每年約有1 500萬人接受暴露后的預防，仍有超過6萬人死于狂犬病，發(fā)病后致死率高達100%[1]。真核細胞中，細胞骨架主要由微管、微絲及中間纖維組成。微絲是由肌球蛋白單體（G-actin）形成的多聚體，位于細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，主要參與細胞變形運動、胞質(zhì)分裂、肌肉收縮及細胞器運動等生物功能。微管（Microtubules，MTs）是細胞質(zhì)中由α、β微管蛋白組裝的一種細長的中空圓管狀細胞器結(jié)構，位于細胞核周圍，在維持細胞形態(tài)、介導物質(zhì)運輸、染色體運動等生命活動中發(fā)揮重要作用[2]。微管的動力學過程對于在細胞微管執(zhí)行胞內(nèi)物質(zhì)遷移及有絲分裂功能有重要影響，其動力學過程受GTP水解過程及微管相關蛋白的影響[3-5]。已有研究表明，病毒在細胞內(nèi)的定向運輸是通過劫持宿主細胞的胞內(nèi)運輸系統(tǒng)實現(xiàn)的[6]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠多瘤病毒（MpyV）[7]、牛乳頭狀瘤病毒（BPV）[8]、艾滋病毒（HIV）[9]、皰疹病毒[10]、痘苗病毒[11]等通過微管介導完成胞內(nèi)運輸?？袢〔《玖Ｗ右阅遗菪问角秩爰毎鸞12]。囊泡在細胞質(zhì)內(nèi)的運輸是沿著細胞骨架微絲或微管運行的，運輸動力來自分子馬達[13]。抑止微管功能的藥物很多，如紫杉醇、秋水仙素、長春花堿、諾考達唑（Nocodazole）等[2]。Nocodazole通過結(jié)合β-微管蛋白抑制微管動力學過程，可阻礙二硫鍵形成和囊泡運輸?shù)裙δ躘14]。因此本研究主要采用微管抑制劑Nocodazole抑止微管正常聚合功能，從而檢測小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞（N2a）內(nèi)RABV感染量變化情況，以初步判定RABV胞內(nèi)感染是否依賴于細胞骨架——微管，為進一步研究RABV胞內(nèi)運輸機制奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 細胞與毒株

小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞（N2a）由人獸共患病研究教育部重點實驗室留種凍存，RABV實驗室標準攻擊毒株CVS-11株由長春獸醫(yī)研究所OIE參考試驗室涂長春研究員惠贈。

1.2? 試驗試劑

細胞培養(yǎng)基高糖DMEM購自Gibco公司，胎牛血清FBS購自NQBB公司， Nocodazole購自Selleck公司，Anti-β tubulin抗體、MTT購自Sigma公司，熒光定量試劑FastStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司。

1.3? 藥物配制及細胞活力檢測

Nocodazole用DMSO溶解為1 mmol/L，-20 ℃凍存。將N2a細胞以104個/孔鋪至96孔板中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將藥物用空培養(yǎng)基稀釋后以0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L的濃度梯度加入細胞，37 ℃孵育6 h，PBS清洗后，更換為含1%雙抗血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，加入5 mg/mL的MTT，37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL/孔溶解甲瓚結(jié)晶，搖床震蕩15 min，492 nm波長測吸光度。數(shù)據(jù)采用以下公式計算：

細胞活力=（藥物處理組吸光度-陰性對照組吸光度）/（無藥對照組吸光度-陰性對照組吸光度）×100%。

1.4? 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

采用FastStart Universal SYBRGreen Master染料進行分析。試驗所使用RABV N基因上、下游引物以及內(nèi)參基因GAPDH上、下游引物[15]見表1。

PCR反應體系（共25 μL）：引物（上、下游）終濃度0.8 μmol/L，模板cDNA 1 μg，SYBR Green 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL。依次加入96孔板中，反應條件為95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)。將得到的Ct值采用2-ΔΔCt（Livak法）進行計算分析。

1.5? Western Blot

將N2a細胞以3×105個/孔鋪至6孔板中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將Nocodazole用空培養(yǎng)基稀釋為25 μmol/L Nocodazole處理細胞，37 ℃下孵育1 h，接毒MOI=1的CVS-11，置37 ℃感作1 h，用PBS溶液清洗3次，加入含1%雙抗血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，RIPA裂解液裂解，收集細胞總蛋白，制樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗Anti-rabies Virus （5B12）4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h。

1.6? ?免疫熒光

將N2a細胞以1×105個/孔鋪至12孔板內(nèi)爬片上，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將Nocodazole用空培養(yǎng)基稀釋至25 μmol/L處理細胞，37 ℃下孵育1 h，接毒MOI=1的CVS-11，置37 ℃感作1 h，用PBS溶液清洗3次，加入含1%雙抗血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，0.1%Triton X-100打孔10 min，5%羊血清室溫封閉2 h，孵育Anti-β tubulin抗體及FITC標記的抗RABV N蛋白抗體，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7? 病毒滴度測定

將N2a細胞以104個/孔鋪至96孔板中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，Nocodazole處理后接毒CVS-11 24 h的細胞上清，依次以10倍倍比稀釋加入到96孔板N2a細胞中，每個梯度設4個復孔，37 ℃下培養(yǎng)48 h，棄上清，PBS溶液輕洗后，80%冷丙酮固定細胞，PBS清洗3次，加入FITC標記的抗RABV N蛋白抗體37 ℃下孵育1 h。觀察熒光孔數(shù)，用Spearman-Karber法計算TCID50值。

1.8? 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 6，免疫熒光信號強度采用Image J軟件分析，數(shù)據(jù)均用x±s表示，試驗組與對照組均用SPSS軟件進行t檢驗，差異顯著*概率值0.01

2? 結(jié)果與分析

2.1? MTT法檢測細胞活力

為驗證微管對RABV胞內(nèi)感染的影響，用Nocodazole作為抑制微管形成的藥物處理細胞。應用MTT法檢測藥物Nocodazole對N2a細胞的毒性，結(jié)果如圖1。與對照組相比，3.125～25 μmol/L Nocodazole處理組吸光度無顯著差異。當Nocodazole達到50 μmol/L時，吸光度顯著降低，說明50 μmol/L Nocodazole對細胞有毒性作用，故本試驗選擇25 μmol/L作為Nocodazole的最適藥物作用濃度。

2.2? RT-qPCR檢測基因水平狂犬病病毒感染量

在細胞培養(yǎng)板中鋪適宜密度的N2a細胞，37 ℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液，加入25 μmol/L Nocodazole處理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培養(yǎng)24 h收集細胞總RNA，以RT-qPCR方法檢測 RABV N基因表達量，結(jié)果如圖2，表明Nocodazole處理N2a細胞后RABV N基因拷貝數(shù)顯著降低25%。

2.3? Western Blot檢測蛋白水平狂犬病病毒感染量

在細胞培養(yǎng)板中鋪適宜密度的N2a細胞，37 ℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液，加入25 μmol/L Nocodazole處理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培養(yǎng)24 h收集細胞總蛋白，采用Western blot方法檢測 RABV N蛋白表達量變化情況，結(jié)果如圖3A，與對照組相比加藥組RABV N蛋白有降低趨勢，灰度分析如圖3B，結(jié)果表明，Nocodazole藥物處理后RABV N蛋白表達量顯著降低約50%，檢測結(jié)果與基因水平一致。

2.4? 免疫熒光檢測蛋白水平狂犬病病毒感染量

在細胞培養(yǎng)板中鋪適宜密度的N2a細胞，37 ℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液，加入25 μmol/L Nocodazole處理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培養(yǎng)24 h后采用免疫熒光方法檢測微管對RABV感染率的影響。20倍鏡下感染RABV N蛋白結(jié)果如圖4A，表明RABV感染率有明顯下降趨勢，熒光強度分析如圖4B，與對照組相比，試驗組病毒感染率顯著降低約為70%，驗證了之前的結(jié)論。3 000倍鏡下觀察可見微管形態(tài)改變，細胞形態(tài)也有所變化，單細胞內(nèi)病毒感染也明顯減少（圖4C）。這些結(jié)果均說明Nocodazole通過阻礙微管形成顯著抑制了RABV的感染。

2.5? TCID50測定病毒滴度

在細胞培養(yǎng)板中鋪適宜密度的N2a細胞，37 ℃過夜培養(yǎng)后棄上清，加入Nocodazole處理1 h，接毒MOI=1的CVS-11感作1 h，培養(yǎng)24 h后收集上清檢測病毒滴度，結(jié)果顯示Nocodazole處理N2a細胞后上清中病毒滴度顯著降低（圖5），其病毒滴度由106.5TCID50/mL降低至104.5TCID50/mL，進一步證實破壞微管形成后RABV的胞內(nèi)感染受到抑制。

3? 討論

狂犬病是由RABV引起神經(jīng)系統(tǒng)障礙的一種高度致死性人畜共患傳染病[1]。RABV致病機制至今尚未闡明。本研究通過Nocodazole處理N2a細胞，并成功檢測到RABV胞內(nèi)感染受到顯著抑制，表明RABV借助微管進行胞內(nèi)感染過程，而在原代神經(jīng)元乃至體內(nèi)RABV是否借助于微管的運輸機制仍需進一步探索。

驅(qū)動蛋白（kinesin）和胞質(zhì)動力蛋白（dynein）作為與微管結(jié)合發(fā)揮作用的兩大類馬達蛋白，與病毒胞內(nèi)運輸有密切關聯(lián)[13]，已有研究發(fā)現(xiàn)多瘤病毒屬中MpyV借助微管及馬達分子dynein進行胞內(nèi)運輸[7]，而kinesin、dynein和RABV胞內(nèi)運輸之間的關聯(lián)尚不十分清楚。病毒從入胞轉(zhuǎn)運到復制中心是由微管介導的逆向運輸實現(xiàn)的，病毒出胞則是依賴微管介導的正向運輸。Nocodazole處理細胞后，上清中病毒滴度顯著降低說明病毒出芽到胞外過程受到一定程度的阻礙，微管所介導的正向運輸是否在RABV感染過程中起主導作用，并且驅(qū)動蛋白和胞質(zhì)動力蛋白在RABV感染的不同階段充當怎樣不同的角色有待研究。

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