王云光 邵歡歡 單純玉

摘? 要： 電穿孔是脂質膜在強電場作用下發(fā)生的一種現(xiàn)象，它是許多生物醫(yī)學技術的基礎。將電穿孔信號的參數(shù)通過優(yōu)化施加到特定的細胞、組織，以達到電穿孔的目的。電穿孔器是一種改變細胞膜通透性的脈沖發(fā)生器。在電穿孔的應用中，我們通?？刂坪驼{整電穿孔脈沖發(fā)生器電場參數(shù)，以適應特定的細胞參數(shù)和生物技術或生物醫(yī)學的應用，即電穿孔的目標。電穿孔脈沖發(fā)生器的設計一直受到生物醫(yī)學應用的驅動。

關鍵詞： 電穿孔; 電穿孔器; 脈沖發(fā)生器; 電場

中圖分類號：TP301? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? 文章編號：1006-8228（2019）05-23-04

Abstract： Electroporation， a phenomenon of lipid membrane under strong electric field， is the basis of many biomedical technologies. The parameters of electroporation signal are applied to specific cells and tissues to achieve the purpose of electroporation. Electroporator is a pulse generator which changes the permeability of cell membrane. In the application of electroporation， we usually control and adjust the electric field parameters of electroporation pulse generator to adapt to specific cell parameters and the application of biotechnology or biomedicine， that is， the target of electroporation. The design of pulse generators for electroporation is always driven by biomedical applications.

Key words： electroporation; electroporator; pulse generator; electric field

0 引言

電穿孔是膜在足夠高的電場作用下發(fā)生的一種現(xiàn)象[1-2]。它是利用脈沖發(fā)生器所施加的外加電場，產生微秒、納秒甚至皮秒級電脈沖作用于細胞膜，使細胞膜通透性發(fā)生改變，從而形成納米級的細小孔道的過程。電穿孔的效果取決于許多物理和生物參數(shù)。這些參數(shù)可以分為電場參數(shù)[3-4]和細胞參數(shù)，這些參數(shù)定義了細胞的狀態(tài)、細胞的環(huán)境和細胞的幾何形狀[5-6]。在電穿孔的應用中，我們通?？刂坪驼{整電場參數(shù)，以適應特定的細胞參數(shù)和生物技術的應用，即電穿孔的目標。電穿孔分為可逆或不可逆兩種?？赡嫘曰虿豢赡嫘耘c細胞存活/死亡有關。可逆電穿孔可進一步應用于大、小分子的引入[7]、細胞的融合和蛋白質的插入[8]。目前，電穿孔技術已廣泛應用于生物技術領域。破壞性的應用程序依賴于的不可逆電穿孔技術早在20世紀60年代已提出。在過去十年中得到越來越多的關注，其功效是可觀的，尤其是在水處理領域，電滲透提高了化學處理的效果，在食品保藏中電滲透提高了食品的保鮮效果。在某些情況下，電滲透已被證明與巴氏殺菌或組織消融同樣有效[9]?；诳赡骐姶┛准夹g的應用目前應用更為廣泛，并在不同的實驗和臨床方案中得到證明，其中比較成熟的兩項應用是電化學[10]和基因轉染[11]。用于電穿孔研究的電穿孔脈沖振幅從mV到kV，頻率從Hz到MHz [12]。因此，在設計電穿孔脈沖發(fā)生器之前，重要的是要知道脈沖發(fā)生器將用于什么應用。例如，對于某些應用，一個非常簡單的電穿孔器就足夠了。然而，基因轉染和細胞電融合則需要輔助信號，如電泳信號和介電信號;多針電極需要電極換向器;細胞器的電穿孔需要非常短的脈沖，臨床應用要求符合安全標準。單細胞電穿孔或平面脂質雙層電穿孔需要低壓電穿孔脈沖[13]。細胞的體外和體內電穿孔需要高壓脈沖。然而，細胞器、細菌或酵母的電穿孔需要更高的電壓。

1 電穿孔脈沖發(fā)生器

電穿孔的可重復性和有效性，在很大程度上取決于所施加的電穿孔信號是否可精確地再現(xiàn)。由于電穿孔過程是由脈沖發(fā)生器局部電場驅動的，大多數(shù)情況下輸出電壓是可控的。脈沖發(fā)生器產生脈沖的特征是脈沖幅度和持續(xù)時間、脈沖數(shù)量、脈沖重復頻率和換向序列。

一個對電穿孔起關鍵作用的參數(shù)是電穿孔脈沖的持續(xù)時間。在短1μs的脈沖中，脈沖的上升時間通常短于源和負載之間的電長度。因此，負載阻抗與脈沖發(fā)生器阻抗匹配是非常重要的，這樣就不會產生強烈的脈沖反射，從而導致脈沖的延長。然而，對于脈沖超過1μs的，更重要的是要考慮負載阻抗在脈沖或采樣過程中發(fā)生變化，并且負載傳導沒有預先定義。另一個需要考慮的重要參數(shù)是脈沖形狀。對于非常高的電壓脈沖，由于高壓開關的工作是離散的，只能使用指數(shù)脈沖和方波脈沖。如果器件產生指數(shù)衰減脈沖，則時間常數(shù)和充電時間作為參數(shù)。如果設備產生方波脈沖，則給出脈沖長度和脈沖重復頻率作為參數(shù)。然而，對于較低的電壓，可以產生任意脈沖，因為這些電壓下的開關也可以線性運行[14]。現(xiàn)就目前電穿孔應用中常用的兩種脈沖發(fā)生器，做一下闡述。

1.1 電容放電脈沖發(fā)生器

這是最早的電脈沖產生的概念，主要用于體外，但有時也用在體內[15]。它產生的是指數(shù)衰減脈沖。它包括可變高壓電源（V）、電容器（C）、開關（S）和可選電阻（R）（圖1）。脈沖發(fā)生器工作在兩個階段，充電和放電，并產生指數(shù)衰減脈沖。充電階段，開關（S）位于1位，可變高壓電源（V）將電容器（C）充電至預設電壓。在放電階段，開關位于位置2，電容器通過連接到輸出端的負載放電。可以近似的放電時間常數(shù)τ等于ZLC，C是電容器的電容，|ZL|是負載阻抗的絕對值。然而，脈沖傳遞過程中生物負載阻抗降低[16]。這也意味著在脈沖過程中時間是恒定的。因此，大多數(shù)商用的基于電容器放電的電穿孔器都有與負載并聯(lián)的內置電阻。其主要目的是為了更好地定義放電時間常數(shù)。也就是說，如果附加電阻與負載并聯(lián)，則放電時間常數(shù)由（R||ZL）C定義，其中R為內部電阻。

一個Marx發(fā)生器（圖2），常用來產生無級衰減脈沖[17]。然而，電容器（C）通過電阻（R）并聯(lián)充電，然后，通過同時接通所有開關（S）通過負載（ZL）串聯(lián)放電。最大電壓負載ZL=VN，時間常數(shù)τ=|ZL| C/N（V為電源電壓，N為電容器數(shù)目）。

1.2 方波脈沖發(fā)生器

方脈沖發(fā)生器幾乎用于所有電穿孔的應用，不僅因為它簡單、經濟，而且它能夠很好地控制和再現(xiàn)有關的電氣參數(shù)。方波脈沖發(fā)生器與電容放電脈沖發(fā)生器非常相似，不同之處在于電壓電源（V）不斷給電容器（C）充電，而電源開關（S）能夠快速開關（圖3）[18]。通常采用快功率金屬氧化物半導體場效應晶體管（MOSFET）或絕緣柵雙極晶體管（IGBT）作為開關。負載必須調整到脈沖形成網(wǎng)絡阻抗，以避免可變振幅傳遞到負載和脈沖反射。脈沖輸出幅值由可變電源的幅值確定，脈沖持續(xù)時間、脈沖重復頻率、可能的脈沖數(shù)由快速電源開關的開關頻率確定。由于開關速度更快、更復雜，脈沖發(fā)生器的控制單元也必須比指數(shù)脈沖發(fā)生器更快、更復雜。

Blumlein發(fā)生器（圖4）用于形成納秒方波脈沖。充電時開關S關閉，高壓電源V將輸電線路T1和T2充電至預設電壓。在放電過程中，開關被打開，傳輸線通過連接到輸出端的負載放電。為了產生沒有反射的方形脈沖，ZL必須是Z0的兩倍（Z0為傳輸線阻抗）。

2 電穿孔脈沖發(fā)生器研究現(xiàn)狀

電穿孔脈沖發(fā)生器在工業(yè)、醫(yī)療等領域具有廣泛的應用。傳統(tǒng)的電穿孔脈沖發(fā)生器，一般采用空氣火花開關和 Blumlein 傳輸線產生脈沖電場。而微秒脈沖作為一種較容易實現(xiàn)的脈沖形式，一般采用電容作為儲能器件，由空氣火花開關直接放電產生脈寬為微秒級別的脈沖，如1.1節(jié)所述。但是由于空氣火花開關不能夠自行關斷，從而使得產生的脈沖一般為指數(shù)型式的衰減波。此外，輸出波形重復性欠佳，可控性差，壽命短，受負載影響大[19]，因此，很難適用于生物醫(yī)學領域的研究。

近年來，隨著電力電子技術的不斷發(fā)展，IGBT、MOSFET及可關斷晶閘管等固態(tài)器件得到廣泛的應用[20]。這些固態(tài)器件具有體積小、效率高、使用壽命長、工作重復頻率高、成本低、工作穩(wěn)定和維護簡單等優(yōu)勢[21]，在脈沖功率領域逐漸得到研究學者的關注。固態(tài)開關的功率容量與開關速度關系如圖5所示。由圖5可以看出，固態(tài)開關的工作速度與開關功率之間存在一定的矛盾關系[22]，因此在電穿孔脈沖發(fā)生器領域中，一般使用多個開關進行串并聯(lián)或經過一定的拓撲結構轉換以實現(xiàn)高壓大功率微秒脈沖輸出。對此，研究者也從未停止對電穿孔脈沖發(fā)生器的研究步伐。他們利用現(xiàn)代先進的電力電子器件，積極投入電穿孔脈沖發(fā)生器的研制，以達到對電穿孔脈沖發(fā)生器參數(shù)的優(yōu)化。

Cronje.Thomas F等[23]采用一種級聯(lián)多電平逆變器拓撲結構的射頻MOSFET的高壓、高頻、雙極性脈沖發(fā)生器的設計，此設計，在80Ω電阻并聯(lián)235pf電容的負載情況下，輸出脈沖頻率高達1MHz，有5級電壓輸出，輸出電壓最高可達1.25kV。該脈沖發(fā)生器用于電化學治療和不可逆電穿孔。其脈沖機制是完全可編程的并且由FPGA控制。選擇了UCC37321柵極驅動器和HCPL-2400光耦合器。采用阻尼電阻器和RCD緩沖電路來減輕輸出電路中的過度振鈴。Vitalij Novickij等[24]設計出一種高頻亞微妙脈沖發(fā)生器。他們利用同步Crowbar開關，實現(xiàn)了大功率方波單脈沖（3kv，60A）的輸出，方波脈沖的持續(xù)時間為100ns-1ms，預定義重復頻率為1Hz到3.5MHz。該電穿孔器成功地滅活了人類病原體白色念珠菌。Mohammad Samizadeh Nikoo[25]等研制了一種dsrd（漂移步進恢復二極管）的兩級脈沖發(fā)生器結構，在輸出端產生較高的峰值功率。從0.3W的平均輸入功率中獲得1.3kw峰值功率的重復納秒脈沖。最大輸出電壓為2.1kV，重復頻率為52Hz。上述電穿孔脈沖發(fā)生器均為方波脈沖發(fā)生器。

綜上所述可知，傳統(tǒng)電穿孔脈沖發(fā)生器由于體積龐大、穩(wěn)定性低、開關使用壽命短、工作頻率低、功率損耗大等原因，只能應用于某些特定的領域。而基于全固態(tài)開關器件的電穿孔脈沖發(fā)生器工作頻率較高，可高達數(shù)kHz，甚至MHz，但是輸出脈沖電壓低。因此可根據(jù)現(xiàn)有的固態(tài)開關技術及電力電子技術對脈沖發(fā)生器進行研制或改進，以實現(xiàn)輸出參數(shù)的靈活可控，提高脈沖輸出電壓，并適用于生物醫(yī)學領域應用。

3 展望

傳統(tǒng)的電穿孔技術是由脈沖發(fā)生器產生的脈沖驅動的。如今，方波脈沖往往是首選。然而，隨著脈沖發(fā)生器變得越來越復雜，更復雜的波形是可能的。這些個別化或混合模式波結合了方波、指數(shù)波和正弦波信號的元素，為特定的應用產生電穿孔脈沖發(fā)生器。未來新的電穿孔脈沖發(fā)生器將促進一些靈活性類型的電穿孔脈沖設備的研發(fā)。在未來，研究者們將嘗試制造越來越短的電穿孔脈沖，并使用特殊的設備將脈沖應用于生物負載。未來，他們利用電穿孔脈沖發(fā)生器治療人體腫瘤，而這一過程中獲得一些數(shù)據(jù)，可能有助于解決電穿孔是如何發(fā)生的。最后，新的電子元件將促進脈沖發(fā)生器實現(xiàn)更高的電壓、電流輸出。

4 結束語

電穿孔脈沖發(fā)生器的設計一直深受生物醫(yī)學應用的驅動，同時電穿孔脈沖發(fā)生器也得到了學術界和產業(yè)界的高度重視和關注。本文對電穿孔脈沖脈沖發(fā)生器的設計進行了研究，從電穿孔的應用出發(fā)，對電穿孔脈沖發(fā)生器機理給出了闡述，對現(xiàn)階段電穿孔脈沖發(fā)生器的發(fā)展現(xiàn)狀做出了總結，并對未來電穿孔脈沖發(fā)生器的發(fā)展趨勢作出展望。多模態(tài)超短脈沖方波電穿孔脈沖發(fā)生器將成為未來的研究趨勢。

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