王耀偉

摘 要：為保證水產品質量安全，用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測魚類水產品中呋喃它酮代謝物的殘留。檢測結果表明，AMOZ標準半對數(shù)曲線為Y=﹣22.34X+67.42，R2=0.9965，試劑盒在添加量為0.5、1.0、2.0μg/kg時，平均回收率分別為94.67%、106.67%、98.17%，除個別產品不符合規(guī)定外，絕大部分水產品未檢出AMOZ。酶聯(lián)免疫法適合對水產品中AMOZ的殘留做快速檢測。

關鍵詞：呋喃它酮;ELISA法;水產品

呋喃它酮（Furaltadone）是一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗生素，對多類細菌、真菌以及原蟲，都可以起到有效的抑制和滅殺效果，同時，使用呋喃它酮時，細菌很難產生耐藥性，并且與其他藥物一同使用時，也不會產生交叉耐藥性?；诖祟愃幬锼w現(xiàn)出的特點，已經在蜜蜂、畜禽、水產等養(yǎng)殖業(yè)得到了廣泛應用，可有效，同時還可以添加至飼料中，作為促生長劑使用。呋喃它酮對光具有較強的敏感性，將其作用于動物機體內后，其半衰期時間較短，一般為幾個小時，在對樣品進行檢測時，是無法發(fā)現(xiàn)原藥的。但是此種物質的代謝產物，會在動物組織內停留較長時間，與細胞膜上的蛋白質結合形成結合態(tài)可在體內殘留數(shù)周，甚至可傳給后代，并且當含代謝物的食品被人類食用后，在胃液的酸性條件下代謝物可從蛋白質中水解出來被人體吸收，因此在分析呋喃它酮的殘留時經常要分析其代謝后的產物。國內外研究表明，呋喃它酮具有嚴重的致癌、致畸、致突變等毒副作用。

基于呋喃它酮所表現(xiàn)出的危害性，歐盟組織于1995年開始，明確規(guī)定不得將其用于食用性動物中，在檢驗中禁止檢測出呋喃它酮，以避免對人體健康造成影響。同時，我國在2002年，農業(yè)部也做出了該方面的規(guī)定，在針對動物性食品進行檢驗時，不得檢測出呋喃它酮。然而，由于其具有高效、廉價等特點，在動物源性食品中，特別是水產品中檢出呋喃它酮代謝物的殘留案例仍有發(fā)生，針對這種現(xiàn)狀，如何通過更加簡便、高效、精準的方法，檢測出食用性動物體內的呋喃它酮，對加強食物安全監(jiān)督就顯得尤為重要?，F(xiàn)階段，在檢測動物源性食品中呋喃它酮殘留時，一般需要先進行衍生處理，然后再采用高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析技術、液相色譜-串聯(lián)質譜法等手段，完成對呋喃它酮的檢測，確定是否含有此類物質。儀器分析法具有較高的準確性，可保證檢測結果的精準度，但也存在一定的局限性，所用設備成本較高，耗費的時間較長，檢測有效率較低，并且對操作人員專業(yè)性有著較高要求，在進行大規(guī)模篩選檢測時，不適合采用該方法。而酶聯(lián)免疫法具有較高的靈敏度，檢測成本較低、整個過程操作較為簡單，且特異性良好，在進行快速篩選檢測時有著較為理想的應用效果。本試驗主要使用酶聯(lián)免疫法快速檢測魚類水產品中呋喃它酮代謝物AMOZ的殘留。

一、檢測原理

測定的基礎是競爭性酶聯(lián)免疫反應，酶標板微孔條上包被有針對被測物抗體的抗體，加入標準品或樣品、酶標記物、被測物抗體溶液于板孔中，游離的被測物與酶標記物競爭抗體結合位點，同時被測物抗體也與微孔條上固定的抗體結合，洗去沒有結合的酶標記物，然后將發(fā)色劑加入到板孔中并孵育，結合的酶標記物可以將粉紅色的發(fā)色劑轉化為藍色產物，加入反應終止液后使顏色由藍色變?yōu)辄S色，用酶標儀在450nm處測定吸光度，在一定濃度范圍內吸光度值與被測物濃度成反比，與標準曲線比較再乘以其對應稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃它酮代謝物的殘留量。

二、材料與儀器

1.主要儀器

MK3型酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司;數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;刀式研磨儀：RETSCH公司;PL602-L電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;3-18k型高速冷凍離心機：Sigma公司;多管漩渦混合儀：美國安勝科技有限公司;N-EVAP-24氮吹儀：美國Organomation公司。

2.試劑與溶液

呋喃它酮試劑盒：德國拜發(fā)集團;檢測下限為0.2μg/kg，包括：96孔酶標板、AMOZ標準品（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL）、洗滌緩沖液（鹽）、抗體、酶標記物、基質/發(fā)色劑、反應終止液等。呋喃類組織前處理試劑盒：德國拜發(fā)集團;包括：1號試劑、2號試劑、3號試劑、4號試劑。正己烷：天津市富宇精細化工有限公司，乙酸乙酯：廣州化學試劑廠。

三、實驗步驟

1.樣品處理

魚去皮，取背部肌肉，用刀式研磨儀制成均質物。

2.樣品制備

（1）稱取0.9g已均質的樣品于15mL離心管中，依次加入3.6mL蒸餾水、0.45mL1號試劑、108μL2號試劑。

（2）振蕩混勻后，在50℃培養(yǎng)3h或者37℃恒溫培養(yǎng)16h。

（3）分別加入4.5mL3號試劑、0.36mL4號試劑、4.5mL乙酸乙酯，渦旋震蕩30秒。

（4）在室溫20-25℃下轉速4000rpm離心10分鐘。

（5）取2.5mL上清液到一干凈離心管中，通過熱氮氣吹干（50-60℃水?。?。

（6）加入1mL的正己烷到吹干的樣品管中溶解干燥物，加入1mL洗滌液，均勻混合。

（7）室溫下轉速4000rpm離心10分鐘。

（8）棄除上層有機溶液（如中間有乳化層，也一并棄除），每孔取出適量的下清液備用。

3.測定

（1）將呋喃它酮試劑盒從冰箱中拿出，回溫至室溫。

（2）取出足夠數(shù)量的微孔條插入微孔架，各個標準液（0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb）和每份待測樣品均做2個平行樣，并記錄標準品及樣品的位置。

（3）加入50μL的標準品或處理好的樣品到各自的微孔中。

（4）加入50μL酶標記物到微孔底部，用手將輕輕搖動微孔板混合。

（5）加入50μL抗體到微孔底部，輕敲微孔架四周，使其充分混合后于室溫（20-25℃）下避光靜置溫育60min。

（6）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（至少拍打三次）以完全除去孔中的液體（如果有氣泡，可用吸耳球吹破），用多通道移液器向孔中加滿250μL洗滌緩沖液，再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，再重復操作洗滌步驟兩次以上。

（7）加入100μL基質/發(fā)色試劑到微孔中，輕敲微孔架四周，使其充分混合。

（8）于室溫下避光靜置溫育15min。

（9）于每一微孔中加入100μL反應終止液，用手將輕輕搖動微孔板混合。

（10）用酶標儀于波長450nm下進行吸光度測定。

4.數(shù)據(jù)處理

以標準品百分吸光度為縱坐標，標準品濃度對數(shù)值為橫坐標，繪制標準半對數(shù)曲線圖。將樣品的百分吸光度代入標準曲線中，從標準半對數(shù)曲線中讀出樣品所對應的濃度，乘以前處理時的稀釋倍數(shù)即為樣品中呋喃它酮代謝物的實際濃度。

四、結果

1.AMOZ標準曲線

根據(jù)AMOZ標準品的ELISA檢測結果繪制標準半對數(shù)曲線，見圖 1。

AMOZ標準半對數(shù)曲線從圖 1可知，標準曲線方程為Y=﹣22.34X+67.42，相關系數(shù)R2=0.9965。式中：Y為B/B0×100;X為樣品濃度的對數(shù)值。

2.回收率檢測

向0.9g生魚空白樣品中分別加入0.45、0.9、1.8ng的AMOZ標準樣品，每個濃度做3個平行，然后按照3.2和3.3的步驟進行前處理及檢測。實驗結果見表 1。

從表 1可以看出：呋喃它酮代謝物回收率在92.00%～113.00%，平均值為99.83%。

3.各魚樣的檢測結果

共檢測了18份水產品，各樣品的測定結果見表 2。

從表 2的結果中可以看出，鯇魚、鳊魚2個樣品都檢出了AMOZ殘留，測定結果分別為0.27、0.61μg/kg，其他樣品都未檢出。

五、結語

本試驗采用ELISA法對水產品中呋喃它酮代謝物的殘留狀況進行了檢測，結果表明絕大多數(shù)的樣品符合規(guī)定，只有極少數(shù)部分有檢出。

ELISA是酶標抗體與抗原進行的抗原-抗體反應。由于酶的專一性催化作用，酶標板上可同時檢測多份樣品，故操作簡易，靈敏度高，重現(xiàn)性好。本實驗的平均回收率在94.67%～106.67%之間，且在0.1～8.1ng/mL測量范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9965。呋喃它酮代謝物含量與百分吸光度的線性方程為Y=﹣22.34X+67.42，因此ELISA非常適于大批量檢測水產品中AMOZ殘留含量。本方法作為一種快速篩選手段，配合精密儀器確證使用，在日常水產品大批量監(jiān)測中有著十分廣闊的應用前景。

參考文獻：

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