吳利森

摘 要：本文以不同濃度稻瘟菌粗毒素處理神農(nóng)265和294水稻幼苗。測(cè)量幼苗的致病性，并檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)分析防御酶系統(tǒng)、可溶性蛋白質(zhì)和同工酶標(biāo)記物。結(jié)果表明，12天培養(yǎng)基中提取的粗毒素對(duì)培養(yǎng)液的毒性最強(qiáng)，水稻種子萌發(fā)，種子萌發(fā)和種子萌發(fā)均有明顯的抑制作用。不同濃度的毒素對(duì)水稻幼苗的POD，SOD和可溶性蛋白有一定的誘導(dǎo)作用;同工酶檢測(cè)顯示粗毒素代替粗毒素，幼苗的POD酶有明顯的變化。

關(guān)鍵詞：水稻;稻瘟病;檢測(cè);實(shí)驗(yàn)分析

稻瘟病又稱稻瘟病和叩頭瘟，是一種由病原真菌引起的水稻病害，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。稻瘟病引起的水稻年產(chǎn)量損失在世界范圍內(nèi)為11%至30%。目前，化學(xué)防治仍然是控制稻瘟病的必要手段。但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用容易造成環(huán)境污染和耐藥性。近年來，生物防治已成為防治植物病害的重要途徑。拮抗微生物不僅具有抑制植物病害的能力，而且對(duì)人和動(dòng)物無害，污染環(huán)境。因此，生物防治被認(rèn)為是預(yù)防植物病害的最有前途的方法之一。本實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)稻瘟病具有良好抑制作用的拮抗菌，研究了拮抗菌對(duì)稻瘟病的防效，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。目的是挖掘多功能高效的稻瘟病菌株，為稻瘟病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

選擇了不同抗性的神農(nóng)265和294的水稻品種的種子。測(cè)試稻瘟病的病原體由ZB1、ZD1、ZD5、ZE1、ZF1等其他生理小種混合組成。

2.水稻稻瘟病菌的制備

在斜面上將稻瘟病菌與PDA（馬鈴薯20%，瓊脂17.5g / L，蔗糖30g / L）連接，并且灰色菌絲體在26度下生長(zhǎng)約2周。 將上述活化的稻瘟病菌接種于培養(yǎng)基（KH2PO4、K2HPO4、MgSO4各0.5g / L，酵母提取物粉末5g / L，葡萄糖20g / L）中，在避光振蕩（150 r / min）的25度光避光培養(yǎng)。用無菌紗布過濾病原體的培養(yǎng)基并10000 r / min離心10分鐘，然后將上清液在高壓下滅菌20分鐘。

3.水稻稻瘟病菌的檢測(cè)

將100個(gè)測(cè)試品種的種子置于含有水，1/4毒素稀釋劑，1/2毒素稀釋劑和毒素原液的4種處理液放置于培養(yǎng)皿中，每天1次換液，并且30℃浸泡3天后計(jì)算發(fā)芽數(shù)和非發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算粗毒素對(duì)種子萌發(fā)的抑制率;另選取測(cè)試材料用清水浸泡培養(yǎng)發(fā)芽后，將水，1/4毒素稀釋液，1/2毒素稀釋液和毒素原液放入4種處理業(yè)的培養(yǎng)皿中。10天后，測(cè)量胚根的胚芽長(zhǎng)度并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

4.水稻幼苗生理生化指標(biāo)的檢測(cè)

樣品處理 將水稻種子在輕質(zhì)培養(yǎng)箱中消毒后，將種子在輕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周后，將水滴入，將水，1/4毒素稀釋劑，1/2毒素稀釋劑和毒素原液加入不同品種的培養(yǎng)皿中，并分別在0、12、24、36、48小時(shí)取樣。

酶的提取 將0.1 g幼苗葉加入到1mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液中以研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，以1000 r / min離心20分鐘，上清液為酶的粗提物，于4℃下保存

過氧化物酶（POD）酶活性測(cè)定 根據(jù)Wu等方法，以愈創(chuàng)木酚為底物，測(cè)定470 nm處的OD值。即1 g/ min蛋白質(zhì)的在470 nm處OD值（酶活性）。

超氧化物歧化酶（SOD）酶活性測(cè)定 按Wu等方法。不添加酶溶液的光照射測(cè)定的OD值為100%。一個(gè)酶活性單位（U）為抑制50%NBT光還原的酶活性，并計(jì)算酶的比活性。

可溶性蛋白（SP）測(cè)定 通過參照Bradfod的G-250法來測(cè)定，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定。

二、結(jié)果與分析

1.粗毒素的毒性測(cè)定

（1）粗毒素對(duì)水稻種子萌發(fā)的抑制率

比較毒素在不同培養(yǎng)時(shí)間的毒性。在培養(yǎng)基的第3天培養(yǎng)中，細(xì)菌逐漸生長(zhǎng)并逐漸生長(zhǎng)。12天后，培養(yǎng)基的顏色逐漸變暗。當(dāng)培養(yǎng)至24日齡時(shí)，橈骨菌絲脫落成平滑的細(xì)菌球，并且培養(yǎng)基幾乎為黑色。在此期間測(cè)量了毒素的毒性。

試驗(yàn)材料在12天不同濃度下對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用（圖1），粗毒素濃度不同，對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用不同，且不同品種的抑制率不同。隨著粗毒素濃度的增加，種子萌發(fā)次數(shù)相對(duì)減少，表明粗毒素對(duì)水稻種子萌發(fā)有一定的抑制作用，種子萌發(fā)抑制率與毒素濃度呈正相關(guān)，抑制率隨著毒素濃度的增加而增加。

（2）粗毒素對(duì)水稻胚根和胚芽的抑制率

不同濃度的試樣材料對(duì)根和芽生長(zhǎng)的抑制結(jié)果表明，毒素處理的胚根和胚芽的根和胚芽長(zhǎng)度顯得低于對(duì)照，表明粗毒素具有一定的抑制作用對(duì)根芽生長(zhǎng)有一定的影響，隨著毒素濃度的增加，胚根對(duì)細(xì)菌的毒性增強(qiáng)。根據(jù)毒素對(duì)兩個(gè)品種的抑制率，繪制粗毒素的毒性曲線（圖2）。從圖中可以看出，神農(nóng)294品種的毒素母液在粗毒素的培養(yǎng)基中于25℃，150 r / min培養(yǎng)，并且在12天時(shí)毒性最強(qiáng)。因此，神農(nóng)294品種的毒素母液的粗毒素適合在12天培養(yǎng)。另外，從2個(gè)品種的發(fā)芽率以及胚根和胚芽的抑制率來看，神農(nóng)265的抗性比神農(nóng)294的高。

2.過氧化物酶活性的測(cè)定

用粗毒素處理后水稻幼苗中POD酶的活性的比較中。由于各濃度的POD酶活性不同，但總的來說，POD酶活性隨時(shí)間增加而增加。不同濃度毒素處理后，神農(nóng)265和294的POD活性均高于對(duì)照。神農(nóng)265在酶活性高峰出現(xiàn)在36 h，其中50%，毒素處理下的酶活性比對(duì)照高2倍。36小時(shí)后，下降接近于控制;神農(nóng)294出現(xiàn)在12h達(dá)到峰值，然后下降，但一般高于對(duì)照水平，50%和毒素濃度下品種的峰值較高?？傮w而言，神農(nóng)294酶活性峰值低于神農(nóng)265。

3.超氧化物歧化酶活性的測(cè)定

經(jīng)過粗毒素處理后，SOD酶的活性開始增加，然后在一段時(shí)間后下降。在神農(nóng)265中，酶活性在24 h達(dá)到最大值，酶活性下降低于對(duì)照水平，神農(nóng)294在12 h酶活性達(dá)到最大值，酶活性下降36-48 h，接近到控制。2個(gè)品種的最大酶活性為50%濃度以下的水稻幼苗活性高峰，說明SOD酶活性對(duì)濃度敏感，而不同濃度粗毒素的SOD活性變化不明顯。

4.可溶性蛋白的測(cè)定

神農(nóng)265和294在12-48 h之間處理時(shí)間下，可溶性蛋白含量會(huì)呈下降趨勢(shì)，不同濃度粗毒素處理的可溶性蛋白含量均低于在36 h時(shí)下降到最低值，而25%濃度的整體趨勢(shì)變化最明顯。

5.過氧化物同工酶的分析

對(duì)其進(jìn)行POD同工酶分析，我們用相同濃度的毒素處理的幼苗的POD發(fā)現(xiàn)其具有明顯的差異，并且酶帶的顏色深度變化很大。并且同一品種的顏色隨著粗毒素濃度的增加而變淺，可以得到稻瘟病菌粗毒素對(duì)過氧化物酶有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增加而增強(qiáng)。

三、結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的粗毒素對(duì)水稻種子的萌發(fā)，胚芽和胚根的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用，說明粗毒素具有一定的致病性，可作為選擇壓力篩選突變體。目前，使用致病毒素篩選水稻稻瘟病突變體的報(bào)道很多。用不同濃度的粗毒素處理2種水稻幼苗后，無論是從生長(zhǎng)潛力還是從抑制率來看，神農(nóng)265都比神農(nóng)294表現(xiàn)出更高的抗性。

不同濃度的毒素對(duì)水稻幼苗防御酶具有一定的誘導(dǎo)能力，可溶性蛋白含量變化顯著。這表明毒素治療的早期階段受到超氧自由基的攻擊并激活SOD防御酶。神農(nóng)294的活性峰值高于神農(nóng)265，表明神農(nóng)294對(duì)毒素較敏感，細(xì)胞膜早期受損。可溶性蛋白質(zhì)的減少表明毒素抑制植物生長(zhǎng)并抑制某些蛋白質(zhì)的合成。POD是細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除劑，因此在毒素應(yīng)激下酶活性增加。對(duì)過氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性測(cè)定知POD酶的活性比SOD更明顯，表明POD對(duì)稻瘟病毒粗毒素更為敏感。目前研究表明，過氧化物酶和稻瘟病與稻瘟病密切相關(guān)。當(dāng)?shù)咀颖坏疚敛「腥緯r(shí)，體內(nèi)的過氧化物酶將發(fā)生顯著變化。通過比較2個(gè)品種的相應(yīng)同工酶譜，可以看出，神農(nóng)265的POD酶活性明顯高于神農(nóng)294，說明毒素對(duì)酶活性的抑制作用較弱，即神農(nóng)265對(duì)稻瘟病菌粗毒素的抗性強(qiáng)于神農(nóng)294，與苗期抗病性鑒定結(jié)果一致，從而了解過氧化物酶和水稻的活性。

參考文獻(xiàn)：

[1]王彥才，徐兆楨，穆永順.水稻抗瘟性與過氧化物酶同工酶的初步研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1991，18（4）：289-292.

[2]譚峰.寒地水稻稻瘟病害的光譜特性及早期檢測(cè)機(jī)理[D]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)， 2012.

[3]Wu Y X， Von T A. Impact of fungicides on active oxygen species and antioxidant enzymes in spring barley （Hordeum vulgare L.） exposed to ozone[J]. Environmental Pollution， 2002， 116（1）：37-47.

[4]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry， 1976， 72（s 1-2）：248-254.