牛寶珍 李娜 劉艷紅 王興龍 陳春麗 文天仙 周亞 杜民

摘要：采集云南省5個不同地域的巨：紅河曼耗（M）、怒江下游（N）、怒江壩（B）、瀾滄江上游（L）、景洪（J）各12尾巨共計60個樣本進行CO Ⅰ基因克隆測序。結(jié)果表明，5個巨群體的T、C、A、G 4種堿基平均含量如下：怒江壩（B）群體T、C、A、G堿基含量分別為274%、27.6%、28.0%、17.0%，景洪（J）群體T、C、A、G堿基含量分別為274%、27.6%、28.0%、17.0%，瀾滄江上游（L）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.4%、27.6%、28.0%、17.0%，紅河曼耗（M）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.3%、27.6%、28.1%、17.0%，怒江下游（N）群體T、C、A、G堿基含量分別為27.3%、27.6%、28.2%、16.9%;5個巨群體的A+T含量均大于C+G含量。用MEGA 5.0軟件構(gòu)建5個群體系統(tǒng)進化樹顯示景洪和紅河曼耗聚為一支，瀾滄江上游大多數(shù)個體單獨聚為一支，怒江壩和怒江下游群體混合聚為一支;曼耗和景洪的群體間遺傳距離（9.096）最大，本研究結(jié)果可為巨的資源保護提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：云南省;巨;CO Ⅰ基因;遺傳多樣性

中圖分類號： S917.4? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0056-03

巨（Bagarius yarrelli）分布于中國云南的怒江、瀾滄江和元江水系，隸屬于硬骨魚綱（Osterichthyes）、鲇形目（Siluriformes）、科（Sisordae）、屬（Bagarius）[1]。巨是產(chǎn)地的主要食用魚類[2]。目前，對于巨魚的研究主要包括巨的生物學(xué)特性[2]和野生巨的生物學(xué)特性[3]、食性[4]、人工繁殖與胚胎發(fā)育[5]和巨細胞色素氧化酶基因多態(tài)性及系統(tǒng)進化的研究[6]、巨野生群體遺傳多樣性的RAPD分析[7]、巨線粒體DNA ND6基因克隆及多態(tài)性分析[8]、巨魚線粒體12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多態(tài)性分析[9]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，目前各種分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于各種生物的分子系統(tǒng)分類和物種鑒定研究，其中線粒體CO Ⅰ基因序列是最常用的分子標(biāo)記之一[10]。Hebert等提出了利用線粒體細胞CO Ⅰ基因的部分序列建立全球動物的DNA條碼（DNA barcode）標(biāo)準數(shù)據(jù)庫，從而進行物種簡單有效的識別和鑒定工作[11]。區(qū)別于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)更加簡單有效且不受人為和客觀因素的影響，因為DNA條形碼技術(shù)是直接用堿基順序來反映物種的客觀指標(biāo)，對于不同地域魚類的遺傳和進化關(guān)系的鑒定更為簡單有效[12]。單云晶等利用線粒體CO Ⅰ基因序列對5個不同的鯉養(yǎng)殖品進行遺傳多樣性分析[13];曹艷等基于線粒體CO Ⅰ基因序列對分布于渤海、黃海、東海和南海海域的6個群體藍點馬鮫遺傳多樣性進行了比較[14];線粒體CO Ⅰ基因序列對于鳥類的系統(tǒng)分類也有很好的依據(jù)性，李濤等對雀科13屬36種鳥類的CO Ⅰ基因部分序列初步分析了雀科鳥類之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[15];這些研究都表明線粒體CO Ⅰ基因序列對于物種的分類以及不同地理位置的同一物種的進化關(guān)系都是簡單且有效的手段。由于現(xiàn)代工業(yè)化的加快，缺乏物種的保護，巨魚數(shù)量減少，已被列入云南省水生野生動植物保護名錄[16]。為保護巨群體的多樣性，對不同巨群體在分子水平上進行遺傳多樣性研究，為今后建立基于DNA分子標(biāo)記的巨物種提供資料基礎(chǔ)。本試驗選用來自瀾滄江上游（L）、怒江壩（B）、紅河曼耗（M）、景洪（J）以及怒江下游（N）不同群體的巨作為試驗材料，采用基因克隆方法獲得線粒體CO Ⅰ基因全序列進行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，探討不同巨群體的遺傳和進化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用2013年10月至2017年6月采自中國云南臨滄市瀾滄江上游（L）、西雙版納傣族自治州景洪市（J）、紅河曼耗江段（M）、怒江傈僳族自治州怒江壩大橋（B）以及怒江傈僳族自治州三江口怒江下游（N）的巨各12尾，依次編號為 1～12，取其背部肌肉組織放入1.5 mL EP管中并浸入無水乙醇，做好標(biāo)記置于冰箱-20 ℃保存。

1.2 試驗方法

采用酚-氯仿方法[13]提取巨基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并保存在 -20 ℃ 冰箱。巨PCR擴增所用的引物為杜民等[17]設(shè)計合成的1對簡并引物，其名稱和序列分別為Baya09F：5′-GAGTGAAAAYCTCCTAGTCYCT-3′，Baya09F：5′-GTTTCTCATTTAATWGAKCCTCC-3′，經(jīng)過瓊脂糖凝膠檢測的目的PCR產(chǎn)物利用凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收、純化、連接轉(zhuǎn)化后，利用通用M13引物進行菌液PCR后將篩選后的陽性克隆樣品送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果利用DNAMAN 5.2.2軟件進行比對，采用DnaSP 5.10.01軟件分析核苷酸序列，采用MEGA 5.0軟件對序列的堿基含量、轉(zhuǎn)換和顛換比分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 試驗結(jié)果

對測序的結(jié)果用DNAMAN 5.2.2軟件對60個巨的核苷酸序列進行比對并用DNAsp[18]軟件比對后發(fā)現(xiàn)在5個群體60個樣本序列共存在59個單倍型，其中怒江下游12個序列存在11個單倍型，其余4個群體的12個序列均發(fā)現(xiàn)12個單倍型;利用MEGA 5.0[19]軟件中的Kimura雙參數(shù)模型[20]分析5個巨群體之間的堿基轉(zhuǎn)換/顛換（R）的范圍在 0.691～31.798，5個群體之間堿基的平均轉(zhuǎn)換/顛換比值范圍為 2.864～9.096。60個體CO Ⅰ基因序列的全長為 1 551 bp，保守位點1 144個、變異位點428個、簡約信息位點267個、單態(tài)突變位點160個。5個巨群體堿基組成百分比結(jié)果見表1。

利用MEGA 5.0軟件中Kimura 2-parameter model參數(shù)對本研究5個群體60個巨CO Ⅰ基因核苷酸序列分別進行群體內(nèi)和群體間的遺傳距離分析，群體間平均遺傳距離見表2，右上角為轉(zhuǎn)換+顛換（Ts+Tv），群體間平均遺傳距離左下角為轉(zhuǎn)換/顛換（Ts/Tv）。

本研究選擇斑馬魚（Danio rerio）作為外群，NCBI上面的登錄號為NC_002333。 利用5個群體60尾巨和斑馬魚基于Kimura雙參數(shù)模型建立的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）系統(tǒng)進化樹見圖1。

3 討論

3.1 巨CO Ⅰ基因堿基組成

線粒體基因?qū)倌赶颠z傳且穩(wěn)定，線粒體CO Ⅰ基因既有足夠的變異，又便于PCR擴增，使其成為DNA條形碼基因之一[21-22]，利用其核苷酸序列的差異，可以進行物種鑒別、遺傳及進化關(guān)系分析，被廣泛應(yīng)用于鳥類、魚類、昆蟲和動物的鑒別[23]。本研究采用基因克隆測序方法比較了云南省內(nèi)3個河流5個不同群體（M-紅河曼耗、N-怒江下游、B-怒江壩、L-瀾滄江上游、J-景洪），各12尾巨共計60個樣本的線粒體CO Ⅰ基因全長序列的堿基組成和單倍型進行分析。結(jié)果表明，巨線粒體CO Ⅰ基因核苷酸序列長度為 1 551 bp，其保守位點1 144個、變異位點428個、簡約信息位點267個、單一突變位點160個。5個群體巨A+T的含量（55.5%）明顯高于C+G的含量（44.5%），G含量（17.0%）最低，這與單云晶等的研究結(jié)果[14]一致。從原核生物到真核生物，其CO Ⅰ基因組中堿基A+T高的現(xiàn)象廣泛存在，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生與基因長度以及密碼子反密碼子間結(jié)合能力的大小有關(guān)[24]。

3.2 基于CO Ⅰ基因的不同巨群體的親緣關(guān)系

5個群體中每12個個體中得到的單倍型除了怒江下游（N）群體為11個單倍型外，其余4個群體各得到12個單倍型，60個個體共得到59個單倍型，這可能是由于本試驗利用的是CO Ⅰ基因的全長序列而不是特定的條形碼所需的部分序列（648 bp）[22];5個群體的單倍型不存在共享的情況，表明5個巨魚群體的遺傳多樣性較高。不同群體的單倍型個體在系統(tǒng)進化樹上交織在一起，其中怒江壩（B）群體和怒江下游（N）交叉最為嚴重，這一結(jié)果與董新培等在日本沼蝦群體中的研究結(jié)果[25]相一致。紅河曼耗（M）群體和景洪（J）群體和另外其他3個不存在交叉情況，且紅河曼耗（M）群體和景洪（J）群體的遺傳距離較小。5個群體中怒江壩（B）群體和怒江下游（N）群體聚為一支、紅河曼耗（M）和景洪（J）聚為一支;瀾滄江上游（L）單獨為一支并且靠近怒江壩（B）和怒江下游（N）的分支，這可能與其不同流域的基因交流有關(guān)系。巨是分布在東南亞的越南、柬埔寨、緬甸、印度及中國云南的元江（紅河）、瀾滄江和怒江的底棲性魚類，由于味道鮮美而受到當(dāng)?shù)鼐用竦南矏郏狙芯恐械木?個群體來自紅河的曼耗段（M），而紅河最終經(jīng)過中國的河口流向越南后最終到達北部灣，2個群體來自瀾滄江的瀾滄縣段（L，瀾滄江上游）和景洪段（J），而最終經(jīng)過緬甸、老撾、泰國、柬埔寨、越南后進入南海，2個群體來自怒江的潞江壩段（B）和三江口段（N，怒江下游），怒江經(jīng)由緬甸后流入印度洋;這樣的地理狀況為巨群體間的基因交流提供了可能性。怒江壩、景洪、瀾滄江上游、曼耗、怒江下游同一群體內(nèi)的遺傳距離分別為4.629、4.000、2.697、3.427、6.718，以怒江下游群體內(nèi)的遺傳距離最大。遺傳距離越大表明該群體內(nèi)的遺傳多樣性越豐

富，本研究中怒江下游群體的遺傳多樣性最豐富、怒江壩群體次之、瀾滄江上游群體的遺傳多樣性最小。遺傳多樣性的豐富程度表明了這個生物群體對于外界環(huán)境的適應(yīng)能力，本研究的結(jié)果可為巨的遺傳資源保護提供分子方面的依據(jù)。

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