韓雙羽 趙靖康 劉慧峰 任媛 蔣琳燕 王霞 劉旭 何媛

青光眼是一種慢性、進行性和不可逆性視神經(jīng)病變，以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的進行性死亡和軸突丟失為特征，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄和視盤凹陷導致的視神經(jīng)損害及視野缺損。2010年，全世界青光眼患者超過6000萬[1]，預計到2040年，全世界青光眼患者將超過1.1億，青光眼將成為世界范圍內(nèi)影響人類健康的疾病之一[2]。高眼壓是青光眼視神經(jīng)損害發(fā)生和發(fā)展機制中最重要的危險因素之一[5]。目前，青光眼唯一有效的治療方法就是降低眼壓[3-4]。因此，建立高眼壓動物模型對于我們明確青光眼發(fā)病機制、尋找新的治療方法預防致盲都是極其重要的[6]。

理想的動物模型應該易于建立、可重復且廉價，最重要的是盡可能與人類青光眼相似。有報道稱，通過烙閉大鼠鞏膜上靜脈能夠建立眼壓中度增高、持續(xù)時間較長的大鼠高眼壓模型[7]。該方法烙閉大鼠鞏膜上靜脈，操作無需進入眼內(nèi)，發(fā)生眼內(nèi)感染風險小，對大鼠眼內(nèi)結(jié)構(gòu)無影響，且易于操作、可重復性高，雖然目前已有相關(guān)研究提示此方法能升高大鼠眼壓，但這類型研究實驗結(jié)果尚不穩(wěn)定，且本研究運用體內(nèi)外實驗觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，包括光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)儀在活體狀態(tài)下測量視網(wǎng)膜厚度，含視網(wǎng)膜全層厚度和神經(jīng)纖維層(nerve fiber layer，NFL)、神經(jīng)節(jié)細胞層(ganglion cell layer，GCL)、內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)的總厚度，這是過去方法沒有涉及的；還包括制作蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色切片測量視網(wǎng)膜各層厚度及計數(shù)RGCs。本研究期望通過烙閉大鼠鞏膜上靜脈得到高眼壓模型，為青光眼視神經(jīng)損傷及保護機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組隨機選取不同體質(zhì)量SD大鼠(雌雄隨機，西安交通大學實驗動物中心提供)40只，按體質(zhì)量分為A組(150～200 g)、B組(>200～250 g)、C組(>250～300 g)、D組(>300～350 g)，每組各10只。隨機選取體質(zhì)量250～300 g的SD大鼠(雌雄隨機，西安交通大學實驗動物中心提供)40只造模，右眼制造青光眼模型定為實驗眼，左眼不作處理定為對照眼。納入標準：(1)無外眼部疾病；(2)雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常。連續(xù)測量3 d眼壓，剔除平均眼壓高于或低于正常眼壓區(qū)間者。

1.1.2 試劑與儀器水合氯醛(上海國藥集團化學試劑有限公司)；鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康公司)；妥布霉素地塞米松眼膏(美國愛爾康公司)；左氧氟沙星滴眼液(日本參天公司)；40 g·L-1多聚甲醛固定液(西安依科生物技術(shù)有限公司)；不可吸收縫合線(強生上海醫(yī)療器材有限公司)；回彈式眼壓計(天津索維電子技術(shù)有限公司)；Cirrus HD-OCT(德國蔡司公司)；光學顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法使用100 g·L-1水合氯醛按3.5～4.0 mL·kg-1體質(zhì)量進行左下腹腹腔注射全身麻醉，給予實驗眼鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，撐開眼瞼，沿上方角鞏膜緣剪開球結(jié)膜，鈍性分離筋膜，暴露鞏膜上靜脈，烙閉大鼠上直肌旁兩條、顳側(cè)一條鞏膜上靜脈，若能發(fā)現(xiàn)明確的下方鞏膜上靜脈，一并烙閉之。烙閉成功的標志：近角鞏膜緣段血管怒張，遠角鞏膜緣段血流消失，無出血。術(shù)畢，以10-0不可吸收縫合線間斷縫合結(jié)膜，縫合后給予妥布霉素地塞米松眼膏，待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi)。術(shù)后以左氧氟沙星滴眼液滴眼，每天2次，連續(xù)7 d。左眼作為對照眼不作處理。

1.2.2 眼壓測量大鼠清醒狀態(tài)下，用回彈式眼壓計測量眼壓，測量3次取平均值。A、B、C、D組大鼠分別于早1000和晚1000測量白天和夜間眼壓。造模大鼠于術(shù)前3 d測量基線眼壓，造模術(shù)后即刻、1～7 d、14 d、21 d、28 d分別測量眼壓，并觀察實驗眼的局部表現(xiàn)。

1.2.3 視網(wǎng)膜厚度測量于術(shù)前及術(shù)后28 d，大鼠全身麻醉狀態(tài)下，用Cirrus HD-OCT測量視網(wǎng)膜厚度，其中以距大鼠視神經(jīng)2000 μm處的全層視網(wǎng)膜厚度及內(nèi)三層，包括NFL、GCL和IPL的總厚度為待測厚度。

1.2.4 觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)于術(shù)后28 d過量麻醉處死大鼠，摘除眼球固定于40 g·L-1多聚甲醛固定液中，24 h后行石蠟包埋切片，切片方向與眼軸平行，切片取經(jīng)視神經(jīng)處，厚度為4 μm，連續(xù)3張切片，并行HE染色。在光學顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，并運用圖像處理軟件測量距離視神經(jīng)2 mm處的視網(wǎng)膜各層厚度，其中以NFL和GCL(內(nèi)層)，IPL和內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)(中層)，外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)和外核層(outer nuclear layer，ONL)(外層)，及NFL、GCL、IPL內(nèi)三層總厚度為待測厚度，計數(shù)距視神經(jīng)2 mm處的20倍物鏡下一個視野(長度約600 μm)視網(wǎng)膜的 RGCs個數(shù)，以及計數(shù)一張切片下一圈(長度約10 mm)視網(wǎng)膜的RGCs個數(shù)。同一切片測量、計數(shù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 眼壓情況

2.1.1 不同體質(zhì)量大鼠基線眼壓A組白天眼壓或夜間眼壓均較B、C、D組低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，B組、C組、D組之間白天眼壓或夜間眼壓差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，A、B、C、D組組內(nèi)夜間眼壓均較白天高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P=0.000)。見表1。

表1 不同體質(zhì)量大鼠基線眼壓

組別白天眼壓/mmHg夜間眼壓/mmHgt值P值A組8.73±1.4810.37±1.404.2100.000B組9.93±1.20?11.83±0.75?5.1610.000C組10.00±1.31?11.56±0.94?5.8940.000D組10.00±1.49?10.48±1.55?4.6360.000F值6.14712.043--P值0.0010.000--

注：與A組相比，*P<0.05。1 kPa=7.5 mmHg

2.1.2 造模大鼠基線眼壓大鼠白天眼壓為7～12(9.85±1.39)mmHg，夜間眼壓為8～13(11.31±1.10)mmHg，大鼠夜間眼壓比白天眼壓高(1.46±1.73)mmHg，差異具有統(tǒng)計學意義(t=13.039，P<0.001)。術(shù)前白天眼壓實驗眼為(9.78±1.42)mmHg，對照眼為(9.93±1.36)mmHg，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.827，P>0.05)。

2.1.3 造模大鼠術(shù)后眼壓對比實驗眼眼壓于術(shù)后即刻達到峰值(22.80±4.74)mmHg，較對照眼高約122%，差異具有統(tǒng)計學意義(t=14.018，P<0.001)，之后眼壓緩慢下降，術(shù)后1～7 d實驗眼眼壓均較對照眼高(均為P<0.001)，術(shù)后第7天實驗眼眼壓較對照眼高約59%(t=9.524，P<0.001)，術(shù)后14 d實驗眼眼壓較對照眼高約41%(t=12.571，P<0.001)，術(shù)后21 d實驗眼眼壓較對照眼高20%(t=5.426，P<0.001)，至術(shù)后28 d實驗眼眼壓與對照眼對比差異無統(tǒng)計學意義(t=1.682，P>0.05)。

2.2 OCT測量視網(wǎng)膜厚度實驗眼術(shù)后視網(wǎng)膜內(nèi)三層厚度較術(shù)前薄(P<0.01)，術(shù)后實驗眼視網(wǎng)膜內(nèi)三層厚度較對照眼薄(P<0.05)。而全層視網(wǎng)膜厚度變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2和圖1。

2.3 HE染色切片觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)計數(shù)20倍物鏡下一個視野(長度約600 μm)視網(wǎng)膜以及計數(shù)一張切片下一圈(長度約10 mm)視網(wǎng)膜的RGCs數(shù)量均顯示實驗眼較對照眼減少(均為P<0.001)。見表3。正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，各層細胞排列緊密，大小均一，視網(wǎng)膜較厚(圖2A)。實驗眼內(nèi)、中、外層視網(wǎng)膜均較對照眼薄(均為P<0.05；圖2B)，其中以內(nèi)層視網(wǎng)膜變化最明顯，減少率達24.75%。

表2 OCT測量視網(wǎng)膜內(nèi)三層及全層厚度情況

組別內(nèi)三層厚度/μm全層厚度/μm術(shù)前實驗眼88.72±6.05208.60±8.18對照眼86.80±7.29210.64±9.74術(shù)后實驗眼81.40±6.61?205.00±8.63對照眼88.48±5.86#206.12±9.55F值6.9251.954P值0.0000.126

注：與術(shù)前實驗眼相比，*P<0.01；與術(shù)后實驗眼相比，#P<0.05

圖1 大鼠視網(wǎng)膜情況。A：正常大鼠OCT；B：術(shù)前實驗眼OCT；C：術(shù)后實驗眼OCT

表3 HE切片觀測視網(wǎng)膜各參數(shù)變化

組別視網(wǎng)膜厚度/μm內(nèi)層中層外層內(nèi)三層RGCs數(shù)量/10 mmRGCs數(shù)量/600 μm對照眼40.80±11.2697.79±15.9571.93±11.46103.94±17.55(442.40±82.62)個(34.59±6.32)個實驗眼30.70±8.7088.28±17.8867.99±10.2091.74±17.44(321.86±64.55)個(26.59±6.48)個F值34.60810.7834.50816.64918.97525.827P值0.0000.0010.0360.0000.0000.000減少率24.75%9.72%5.48%11.74%27.25%23.02%

注：減少率=(1-對照組均值/實驗組均值)×100%；內(nèi)層：NFL+GCL；中層：IPL+INL；外層：OPL+ONL；內(nèi)三層：NFL+GCL+IPL

圖2 HE染色切片觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(×400)。A：對照眼；B：實驗眼。IS/OS：光感受器內(nèi)外節(jié)，RPE：視網(wǎng)膜色素上皮層

2.4 其他眼部情況40只SD大鼠中4只術(shù)后出現(xiàn)角膜潰瘍，眼壓高達40 mmHg，其中3只角膜穿孔，眼球破裂，眼壓最高達68 mmHg；1只角膜潰瘍愈合，形成角膜白斑。少數(shù)高眼壓大鼠出現(xiàn)角膜水腫。

3 討論

青光眼是最常見的致盲性眼病之一，人類青光眼的發(fā)生發(fā)展中最重要的可調(diào)節(jié)危險因素是眼壓，降眼壓治療不僅可以降低高眼壓癥患者轉(zhuǎn)變?yōu)榍喙庋鄣娘L險，同時可以阻止青光眼疾病的進展[8]。動物高眼壓模型是研究青光眼的基礎，從1870年以來，人們就開始嘗試用不同的方法誘導建立動物高眼壓模型，包括高滲鹽水鞏膜上靜脈注射模型，激光誘導高眼壓模型，微球注射模型和自發(fā)或遺傳操作的突變型青光眼模型等[9-13]，這些方法有的價格昂貴，有的操作復雜。本實驗選取鞏膜上靜脈烙閉法建立高眼壓模型，該方法操作簡單、廉價且可重復性高。正常情況下，房水從前房的小梁網(wǎng)進入Schlemm管，再由集合管或房水靜脈匯入鞏膜上靜脈(常規(guī)途徑)或由葡萄膜鞏膜途徑流出眼外，而鞏膜上靜脈引流的房水占房水流出總量的85%～95%。各種因素導致的鞏膜上靜脈壓升高，均可引起眼壓增高。鞏膜上靜脈烙閉法就是據(jù)此原理形成的方法。本實驗選取大鼠是由于嚙齒類動物易于獲取，且具有與人眼相似的房水外流結(jié)構(gòu)，唯一不足的可能是大鼠是膠質(zhì)篩板，而非纖維篩板，Kim等[14]研究認為，靈長動物的RGCs損傷是由于軸突與篩板的相互作用引起的。

本研究將不同體質(zhì)量大鼠分組進行基線眼壓測量，發(fā)現(xiàn)當體質(zhì)量大于200 g后，眼壓不隨體質(zhì)量增加而改變。許天新等[15]報道，雄性SD大鼠約達7周齡體質(zhì)量超過200 g，雌鼠約達8周齡體質(zhì)量超過200 g，均達到性成熟期。本研究預實驗階段，曾行不同體質(zhì)量大鼠灼烙術(shù)，發(fā)現(xiàn)150～250 g大鼠鞏膜壁極薄，能透現(xiàn)脈絡膜顏色，灼烙時極易使鞏膜穿孔，而體質(zhì)量大于250 g的大鼠明顯比體質(zhì)量小的大鼠的鞏膜更致密，不易烙穿。故綜合考慮眼壓及鞏膜情況，最終選擇體質(zhì)量為250～300 g的大鼠。

本方法可維持眼壓升長達3周，造模成功率達75%。術(shù)后眼壓即刻升高達峰值之后緩慢下降這一特征與Bai等[7]報道的結(jié)果一致，但維持時間較其短。為探究原因，我們于術(shù)后3周將部分大鼠再次麻醉，打開球結(jié)膜發(fā)現(xiàn)部分烙閉后的靜脈形成側(cè)支循環(huán)而再通。根據(jù)Bang等[16]的研究，當急性升高的眼壓恢復正常后，視功能可恢復，但大約10 mmHg的急性眼壓升高可產(chǎn)生永久性視功能障礙，當大鼠眼壓達60 mmHg，并持續(xù)約105 min，則可以產(chǎn)生永久性視功能喪失。而本實驗引起了3周眼壓升高，且術(shù)后即刻眼壓升高大于10 mmHg，根據(jù)Bang等[16]的報道，本研究中大鼠視功能也受到了損害，而這一特征在視網(wǎng)膜厚度及RGCs計數(shù)結(jié)果中得到了驗證。

Matlach等[17]研究表明，Cirrus HD-OCT在測量視盤旁視神經(jīng)纖維層和黃斑視神經(jīng)纖維層-RGC層-IPL厚度可重復性高，而且確定視盤旁視神經(jīng)纖維層和黃斑視神經(jīng)纖維層-RGC層-IPL厚度是青光眼患者RGCs損傷的最敏感參數(shù)。本研究選用Cirrus HD-OCT測量視網(wǎng)膜全層厚度及內(nèi)三層(NFL、GCL、IPL)厚度，結(jié)果顯示，術(shù)后視網(wǎng)膜內(nèi)三層厚度較術(shù)前變薄，而視網(wǎng)膜總厚度無顯著改變，內(nèi)三層對應著RGCs的軸突、細胞體，借此驗證了RGCs對高眼壓更敏感，也驗證了Matlach等[17]對于內(nèi)層視網(wǎng)膜對眼壓更敏感這一結(jié)論。

龐國龍等[18]研究表明，大鼠高眼壓第1周、第2周RGCs數(shù)量減少，RGC層、NFL、IPL、OPL、INL、ONL水腫，到高眼壓第3周RGCs明顯萎縮、視網(wǎng)膜各層變薄，尤其是NFL。本研究結(jié)果顯示，高眼壓引起了內(nèi)層視網(wǎng)膜變薄，即RGCs及其軸突受損，還引起了IPL、OPL、INL、ONL的變薄，由內(nèi)到外減少率依次增加，說明損傷是由內(nèi)向外蔓延的，易損性由內(nèi)向外依次降低，這一特征與龐國龍等[18]的研究相符，皆為內(nèi)層視網(wǎng)膜最易受到高眼壓的影響。而進一步研究有待更精細的形態(tài)學觀察。

綜上所述，本實驗證明鞏膜上靜脈烙閉法可引起SD大鼠3周的眼壓升高，且使RGCs數(shù)量減少、視網(wǎng)膜變薄，尤其是內(nèi)層視網(wǎng)膜。本方法具有操作簡單，重復性好，成模率高，升高的眼壓可穩(wěn)定維持一定時間等優(yōu)點，是較為理想的大鼠高眼壓模型制備方法，值得進一步完善及應用。