馬 壘,趙文慧,郭志彬,王道中,趙炳梓

1 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所,土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210008 2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,合肥 230031 3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049

砂姜黑土廣泛分布于安徽、河南,山東等省,是我國(guó)主要的中低產(chǎn)田之一,其中磷有效性不足是砂姜黑土作物生產(chǎn)的重要限制因素[1-2]。施用化學(xué)磷肥是提高磷素有效性,提升作物產(chǎn)量的最主要的農(nóng)業(yè)措施之一[3],但同時(shí)也可能影響地下微生物[4]。我們之前的研究表明,長(zhǎng)期施用磷肥可顯著提高砂姜黑土酶活性和細(xì)菌多樣性,同時(shí)改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[5]。然而長(zhǎng)期施用磷肥對(duì)砂姜黑土真菌群落的影響目前仍不清楚。

真菌是農(nóng)田土壤中最常見(jiàn)的微生物之一,根據(jù)營(yíng)養(yǎng)方式可將其劃分為腐生營(yíng)養(yǎng)型、共生營(yíng)養(yǎng)型和病原型等三種類型,在土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)/抑制作物生長(zhǎng)和控制作物疾病等方面具有重要作用[6]。真菌的生長(zhǎng)受溫度、pH、水分和養(yǎng)分等多種土壤環(huán)境因子的影響[6]。磷肥的施用一方面可通過(guò)增加磷素有效性直接影響真菌群落結(jié)構(gòu),同時(shí)還可以通過(guò)改變土壤pH、碳氮有效性以及影響植物生長(zhǎng)等間接影響真菌群落結(jié)構(gòu)[4,7-8]。Beauregard等[4]對(duì)單一苜蓿耕作的壤質(zhì)粘土進(jìn)行8年不同磷肥施用梯度(不施磷肥、P2O520 kg/hm2和P2O540 kg/hm2)處理后,發(fā)現(xiàn)真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,但并未對(duì)真菌多樣性和叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。而Cheng 等[9]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)90年長(zhǎng)期施用磷肥(P2O5100 kg/hm2)后叢枝菌根真菌多樣性顯著降低,并且形成了一個(gè)與未施磷處理明顯不同的群落結(jié)構(gòu)。這種不一致的結(jié)果可能是由于不同的磷肥施用量、土壤質(zhì)地或作物輪作方式導(dǎo)致。雖然關(guān)于長(zhǎng)期施用磷肥對(duì)真菌影響已有一些研究,但這些研究或者利用低分辨率的方法(比如DGGE,PLFA等)[4,10],或者沒(méi)有設(shè)置不同的磷肥梯度來(lái)研究不同磷肥施用量對(duì)真菌群落的影響[9]；且多數(shù)研究集中在施磷對(duì)真菌多樣性、群落組成的影響[4,7-11],而長(zhǎng)期不同磷肥施用量下真菌網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成和物種間的關(guān)系仍不清楚。

本研究以安徽蒙城砂姜黑土氮磷鉀肥肥效長(zhǎng)期定位試驗(yàn)為平臺(tái),選取P0(不施磷肥)、P1(P2O545 kg/hm2)和P2(P2O590 kg/hm2)3個(gè)磷肥施用梯度。利用現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù),測(cè)定經(jīng)過(guò)21年長(zhǎng)期施用磷肥后真菌群落多樣性及群落組成的差異。同時(shí)利用新興的網(wǎng)絡(luò)分析手段,研究不同磷肥施用量下真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,探索磷肥施用對(duì)真菌種間關(guān)系的影響。

1 材料與方法

1.1 長(zhǎng)期試驗(yàn)樣地概況

長(zhǎng)期試驗(yàn)位于農(nóng)業(yè)部蒙城砂姜黑土生態(tài)環(huán)境站內(nèi)(33°13′N,116°35′E)。該試驗(yàn)站地處皖北平原,屬于暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,年平均降雨量872.4 mm,年均氣溫14.8℃,供試土壤為砂姜黑土區(qū)最具代表的普通砂姜黑土。試驗(yàn)開(kāi)始(1994年)前土壤基本理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)9.90 g/kg,全氮0.79 g/kg,全磷0.28 g/kg,有效磷7.80 mg/kg,速效鉀111.00 mg/kg。試驗(yàn)樣地1994—1998年為小麥玉米輪作,1998—2015年為小麥大豆輪作。

1.2 長(zhǎng)期試驗(yàn)樣地設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置9個(gè)處理,本研究選取其中3個(gè)處理,即：(1)P0(不施磷肥)；(2)P1(P2O545 kg/hm2)；(3)P2(P2O590 kg/hm2)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),小區(qū)面積19 m2,完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。除磷肥施用差異外,所有處理氮肥和鉀肥施用量一致,其中N 187.5 kg/hm2,K2O 135 kg/hm2。氮肥為尿素,磷肥為普鈣,鉀肥為氯化鉀。小麥、大豆品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N,每5—10年更換一次。

1.3 土壤樣品采集

所有土壤樣品于2015年6月小麥成熟期時(shí)采集,即截止樣品采集時(shí),各處理已經(jīng)歷總共21年不同施肥處理。采用S采樣法,使用直徑5 cm的土鉆采集0—15 cm的表層土壤,每個(gè)小區(qū)采取9鉆混合成一個(gè)土壤樣品。所有樣品采用冰袋保鮮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品在去除植物根系和大的石塊后過(guò)2 mm篩混勻。所有樣品分為兩部分,一部分室溫下風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定,另一部分置于-80℃用于土壤DNA提取。

1.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

1.5 土壤DNA提取及真菌ITS1基因高通量測(cè)序

土壤DNA采用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)試劑盒提取。每個(gè)樣品稱取0.50 g鮮土,按照說(shuō)明書操作提取DNA。

選取真菌ITS1區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。PCR擴(kuò)增采用特異性引物ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。每個(gè)樣品前端引物均含有不同的7 bp Barcode用于區(qū)分不同樣品。PCR擴(kuò)增條件包括94℃ 5 min；90℃ 60 s,55℃ 60 s,72℃ 75 s,30個(gè)循環(huán),之后72℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用QIA quick PCR Purification kit(Qiagen)進(jìn)行純化。將不同樣品的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物等摩爾混合后,采用Illumina公司MiSeq測(cè)序儀完成序列分析(委托上海派森諾生物科技股份有限公司測(cè)定)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

高通量測(cè)序所得序列按照以下步驟進(jìn)行分析[5]：(1)雙端序列采用FLASH進(jìn)行拼接；(2)使用Cutadapt切除引物；(3)采用QIIME(1.91)去除質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20,序列短于200 bp的低質(zhì)量序列；(4)采用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)去除嵌合體；(5)得到的高質(zhì)量序列采用Uparse軟件,以97%相似度進(jìn)行OTU劃分,采用Blast方法以UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)為比對(duì)進(jìn)行注釋。將未注釋到門水平序列刪除后,所有樣品隨機(jī)抽取27,000條序列進(jìn)行后續(xù)分析。真菌香農(nóng)指數(shù)在QIIME中計(jì)算?；贐ray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)、冗余分析(RDA)均使用R 2.15.3軟件的vegan包進(jìn)行。使用vegan包中的“mrpp”、“anosim”和“adonis”函數(shù)進(jìn)行真菌群落結(jié)構(gòu)相似性檢驗(yàn),使用“bioenv”函數(shù)得到最優(yōu)的RDA模型。Linear Discriminant analysis(LEfSe)在Galaxy網(wǎng)站(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)中進(jìn)行,其中LDA值大于3的物種為顯著差異物種。采用SparCC 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,為了減少網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度,只選取SparCC 值|r|>0.80,P<0.001的關(guān)系用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的計(jì)算和網(wǎng)絡(luò)圖形制作在Gephi 0.9.2軟件中進(jìn)行。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析,采用新復(fù)檢驗(yàn)法(Duncan′s New Multiple Range Test)進(jìn)行平均值顯著性多重比較(P<0.05)。采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤理化性質(zhì)如表1所示。長(zhǎng)期不同磷肥施用量對(duì)土壤pH和全氮均沒(méi)有顯著影響(P>0.05,下同),但土壤有機(jī)碳在P2處理中顯著升高(P<0.05,下同),分別比P0和P1處理提高7.65%和10.33%。全磷和可溶性有機(jī)碳含量均隨著磷肥施入量的增加而顯著升高,其中P2和P1處理全磷分別比P0處理增加40.00%和24.00%,可溶性有機(jī)碳分別增加31.36%和15.60%。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮在不同施肥處理中呈相反的變化趨勢(shì),其中銨態(tài)氮按照P0

表1 長(zhǎng)期不同磷肥施用量對(duì)砂姜黑土理化性質(zhì)的影響Table 1 Physico-chemical properties of the lime concretion black soil relative to long-term P fertilization

2.2 真菌群落多樣性

經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后,總共得到423426條高質(zhì)量序列(每個(gè)樣品27137—64626條序列),所有樣品均一化為27000條序列后,以97%相似度與UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),總共得到321個(gè)OTU(每個(gè)樣品237—263個(gè)OTU),這些OTU歸屬于10個(gè)門,29個(gè)綱,66個(gè)目,107個(gè)科和147個(gè)屬。以香農(nóng)指數(shù)表征真菌α-多樣性(圖1),發(fā)現(xiàn)當(dāng)序列數(shù)達(dá)到27,000條時(shí),香農(nóng)指數(shù)在P0處理中最高(5.43),P1處理居中(5.10),而P2處理最低(4.99),但各處理間差異未達(dá)顯著性水平。相關(guān)性分析表明(圖1),香農(nóng)指數(shù)與土壤中全磷(r=-0.678,P=0.045)和有效磷(r=-0.677,P=0.045)均成顯著負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明隨著磷肥施入量的增加,土壤全磷和有效磷含量隨之升高,而真菌α-多樣性有不斷降低的趨勢(shì)。

圖1 長(zhǎng)期不同磷肥施用量對(duì)砂姜黑土真菌群落α多樣性的影響及其與全磷和有效磷之間的關(guān)系Fig.1 Fungal alpha-diversity of the lime concretion black soil relative to long-term P fertilizationP0：不施肥對(duì)照,unamended control；P1：施用P2O5 45 kg/hm2,chemical P fertilizer was applied at P2O5 45 kg/hm2；P2：施用P2O5 90 kg/hm2,chemical P fertilizer was applied at P2O5 90 kg/hm2；AP：available phosphorus；TP：total phosphorus

對(duì)均一化的OTU表,基于Bray-Curtis距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(圖2)發(fā)現(xiàn),主坐標(biāo)的前兩軸總共解釋了63.63%的總方差,其中第一軸和第二軸分別解釋46.17%和17.46%的總方差。不施用磷肥的P0處理聚集在左側(cè),而施用磷肥的P1和P2處理聚集在右側(cè)。分別采用MRPP、ANOSIM和ADONIS的方法對(duì)不施磷肥的P0處理與施用磷肥的P1和P2處理真菌群落進(jìn)行相似性檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌群落結(jié)構(gòu)在施用磷肥后發(fā)生顯著變化。以不同處理中OTU豐度作為響應(yīng)變量,以土壤理化性質(zhì)作為解釋變量進(jìn)行冗余分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOC和TP是導(dǎo)致施磷后真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子。以上結(jié)果表明長(zhǎng)期施用磷肥后真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,這種變化與土壤養(yǎng)分(TP和DOC)密切相關(guān)。

圖2 長(zhǎng)期不同磷肥施用量下砂姜黑土真菌群落結(jié)構(gòu)及其與土壤理化因子關(guān)系Fig.2 Fungal community structure and its relationship with soil properties of the lime concretion black soil relative to long-term P fertilizationMRPP：多響應(yīng)置換過(guò)程分析,multiple response permutation procedure；ANOSIM：相似性分析,analysis of similarities；ADONIS：多元方差分析,analysis of variance using distance matrices；TP：全磷,total phosphorus；DOC：可溶性有機(jī)碳,dissolved organic carbon

圖3 長(zhǎng)期不同磷肥施用量下砂姜黑土真菌群落相對(duì)豐度大于1%的門、綱以及屬水平上差異物種Fig.3 Relative abundance of the most abundant phyla,class and the influential species at genus level relative to long-term P fertilization柱子高度和誤差線代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(n=3),不同字母表示在不同處理間顯著差異(Duncan 法,P<0.05),條形圖長(zhǎng)度代表LDA值,只顯示不同組間差異顯著的物種(LDA>3)

2.3 真菌群落組成

子囊菌門(Ascomycota)是砂姜黑土中的優(yōu)勢(shì)菌(圖3),其相對(duì)豐度在9個(gè)樣品中在65.71%—79.86%之間。其余相對(duì)豐度大于1%的門主要為被孢霉菌門(Mortierellomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota),其在3個(gè)處理中平均相對(duì)豐度分別為9.54%和2.12%。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)不同真菌物種對(duì)磷肥施用響應(yīng)不同(圖3)。在門水平上(圖3),子囊菌門相對(duì)豐度隨磷肥施入而顯著增加,P2和P1處理分別比P0高出9.87%和11.75%；而被孢霉菌門則隨磷肥施入而顯著降低,P2和P1分別比P0降低42.63%和43.81%；其余菌門在3處理間差異未達(dá)到顯著水平。

在綱水平上(圖3),子囊菌綱(Sordariomycetes)相對(duì)豐度最高,在3個(gè)處理中平均相對(duì)豐度占總序列數(shù)的45.31%。其余相對(duì)豐度大于1%的分別為散囊菌綱(Eurotiomycetes)、被孢霉菌綱(Mortierellomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)子囊菌綱相對(duì)豐度隨磷肥施入而顯著升高,P1和P2處理分別比P0提高15.97%和28.63%；盡管被孢霉菌綱相對(duì)豐度在P1和P2處理間沒(méi)有顯著差異,但它們比P0處理分別降低了42.63%和43.82%；對(duì)錘舌菌綱來(lái)說(shuō),只有P2處理顯著降低其豐度達(dá)48.41%,而P1與P0處理間沒(méi)有顯著差異；不同磷肥施用量對(duì)散囊菌綱和座囊菌綱相對(duì)豐度沒(méi)有顯著影響。

采用LEfSe方法,在屬水平上對(duì)真菌群落進(jìn)行差異物種分析,結(jié)果如圖3所示。Sagenomella、Simplicillium、Magnaporthiopsis、Schizothecium和Nigrospora等5個(gè)屬相對(duì)豐度在P0處理中最高；Plenodomus、Penicillium和Arthrobotrys等3個(gè)屬相對(duì)豐度在P1處理中最高；而Cyphellophora、Zopfiella、Guehomyces、Mortierella和Mucor等5個(gè)屬相對(duì)豐度在P2處理中最高。

2.4 真菌群落種間關(guān)系

采用SparCC軟件分別計(jì)算3種磷肥施用量下真菌OTU之間的關(guān)系,結(jié)果如圖4所示。其中圖中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)OTU,節(jié)點(diǎn)的大小代表其擁有的連接數(shù)量多少,不同節(jié)點(diǎn)顏色代表不同真菌門類；兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間的實(shí)線連接代表正相關(guān)關(guān)系,虛線連接代表負(fù)相關(guān)關(guān)系。對(duì)各網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)子囊菌門和擔(dān)子菌門是3個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的優(yōu)勢(shì)菌。其中子囊菌門分別在P0、P1和P2處理中占所有節(jié)點(diǎn)數(shù)量的61.54%、72.12%和74.79%,而擔(dān)子菌門分別為8.97%、6.73% 和6.72%。

圖4 長(zhǎng)期不同磷肥施用量對(duì)真菌群落網(wǎng)絡(luò)組成的影響Fig.4 Co-occurrence network analysis of fungal communities relative to long-term P fertilization

不同磷肥施用量下網(wǎng)絡(luò)參數(shù)如表2所示。其中平均路徑長(zhǎng)度表示網(wǎng)絡(luò)中任意兩點(diǎn)間的平均距離；網(wǎng)絡(luò)直徑代表任意兩個(gè)節(jié)點(diǎn)距離中的最大值；平均聚類系數(shù)和模塊性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)聚集在一起的程度；平均度代表每個(gè)節(jié)點(diǎn)擁有的連接的平均值。所測(cè)網(wǎng)絡(luò)模塊性指數(shù)均高于0.4,說(shuō)明3個(gè)網(wǎng)絡(luò)均具有模塊化結(jié)構(gòu)。網(wǎng)絡(luò)中連接的數(shù)量和平均度可用來(lái)表征網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度,這兩種指標(biāo)均隨磷肥施入量的增加而升高,說(shuō)明施用磷肥可提高真菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度,從而可能提高其穩(wěn)定性。施用磷肥的P2和P1處理正相關(guān)比例增加,分別較P0處理高出10.43%和25.46%,而負(fù)相關(guān)比例分別比P0處理降低9.27%和22.63%。此外P0處理中具有較高的平均聚集系數(shù),說(shuō)明該處理中各節(jié)點(diǎn)聚集程度更高。

表2 長(zhǎng)期不同磷肥施用量下真菌群落網(wǎng)絡(luò)指標(biāo)的變化Table 2 Key topological features of fungal community networks relative to long-term P fertilization

3 討論

3.1 長(zhǎng)期施用磷肥對(duì)真菌多樣性的影響

我們之前的研究表明,在砂姜黑土區(qū)細(xì)菌α-多樣性隨著磷肥的施入而顯著升高,而這主要與土壤中TP和DOC含量的升高有關(guān)[5]。而本研究結(jié)果表明,與細(xì)菌相反,真菌α-多樣性隨磷肥施入量的增加而不斷降低的趨勢(shì),且與TP(r=-0.678,P=0.045)和AP(r=-0.677,P=0.045)均成顯著負(fù)相關(guān)(圖1)。He等[11]發(fā)現(xiàn)在青藏高原草甸土中連續(xù)三年施用磷肥后,真菌群落α-多樣性顯著降低。與之相似,Liu等[8]通過(guò)培育試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在紅壤中施用磷肥后真菌α-多樣性顯著降低。施磷后真菌α-多樣性的降低可能與土壤中P有效性變化有關(guān)。研究表明在低N∶P環(huán)境中(P豐富),細(xì)菌活性明顯高于真菌,而在高N∶P環(huán)境中(P匱乏),真菌活性則顯著高于細(xì)菌[13]。本研究中N∶P隨著磷肥的施入而不斷降低(表1),因此這種N和P有效性的變化可能更利于細(xì)菌的生長(zhǎng),從而導(dǎo)致細(xì)菌α-多樣性升高,而真菌α-多樣性降低。此外,施用磷肥后,土壤中捕食真菌的土壤動(dòng)物增加,也可能導(dǎo)致真菌α-多樣性的降低[8]。

主坐標(biāo)分析結(jié)果表明不施用磷肥與施用磷肥處理的真菌群落結(jié)構(gòu)沿著第一軸分開(kāi)(圖2),表明長(zhǎng)期施用磷肥后真菌群落β-多樣性發(fā)生明顯變化。冗余分析的結(jié)果進(jìn)一步表明TP和DOC是導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)差異的最主要環(huán)境因子(圖2)。本研究中隨著磷肥施入量的增加,土壤中TP含量顯著升高(表1),而P0處理中磷含量的不足可能直接影響真菌的生長(zhǎng)。磷是真菌生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)元素,磷素不足可導(dǎo)致真菌DNA、RNA、功能酶和細(xì)胞壁等合成受阻,從而直接限制真菌生長(zhǎng)[14]。此外真菌是農(nóng)田土壤中植物殘?bào)w的最主要分解者,而植物殘?bào)w中C∶P遠(yuǎn)高于微生物[15],因此土壤磷素缺乏可能會(huì)影響真菌對(duì)有機(jī)碳的分解利用,從而間接影響真菌的生長(zhǎng)。DOC升高是導(dǎo)致施磷后真菌群落結(jié)構(gòu)變化的另一個(gè)環(huán)境因子。土壤中的真菌大多都是異養(yǎng)微生物,需要吸收外界碳來(lái)獲取養(yǎng)分和能源[6]。不同微生物對(duì)碳有效性適應(yīng)性不同,其中一些生長(zhǎng)較快的r-策略型物種適宜在高濃度碳環(huán)境中,而一些生長(zhǎng)緩慢的k-策略型物種則適宜在低濃度碳環(huán)境中[16]。前人的研究結(jié)果表明,pH對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)形成具有重要影響[17-18],而本研究中不同施磷處理間pH變化差異很小(5.22—5.53),因此可能對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響并不顯著。上述結(jié)果表明在砂姜黑土區(qū)長(zhǎng)期施用磷肥后,土壤養(yǎng)分(TP和DOC)的變化是導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要環(huán)境因子。

3.2 長(zhǎng)期施用磷肥對(duì)真菌群落組成的影響

與以往本地區(qū)的研究結(jié)果相同,子囊菌門是砂姜黑土中的優(yōu)勢(shì)菌種[18]。在門和綱水平上進(jìn)行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)子囊菌門及其門下的子囊菌綱均隨著磷肥施入而顯著升高(圖3)。子囊菌門是土壤中主要的腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌,是土壤中動(dòng)植物殘?bào)w的主要分解者[19]。研究認(rèn)為子囊菌門適于高肥力的土壤環(huán)境,其相對(duì)豐度隨著氮肥、磷肥、秸稈的施入而顯著升高[11,19-20]。本研究中長(zhǎng)期施用磷肥后土壤中SOC、DOC、TP和AP等養(yǎng)分指標(biāo)顯著增加(表1),可能會(huì)有利于子囊菌門的生長(zhǎng)。歸屬于子囊菌門的錘舌菌綱相對(duì)豐度在施磷處理中顯著降低(圖3)。研究表明錘舌菌綱可以與植物共生生長(zhǎng),其相對(duì)豐度與AP含量成極顯著負(fù)相關(guān)[17,20-21]。因此可以推斷作物在磷含量高的土壤中與錘舌菌綱共生模式減弱,導(dǎo)致該物種在高磷土壤中相對(duì)豐度顯著降低。被孢霉菌門及被孢霉菌綱相對(duì)豐度在施用磷肥后也顯著降低(圖3)。研究表明被孢霉菌門中的一些真菌具有溶磷作用[7],可以溶解土壤中的難利用的磷素,因此可以推斷其在低磷土壤中更具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

采用LEfSe方法,在屬水平上對(duì)真菌群落組成進(jìn)行差異物種分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P0處理中Simplicillium、Magnaporthiopsis、Sagenomella和Nigrospora等相對(duì)豐度最高,其中Simplicillium和Magnaporthiopsis為植物病原菌[22-23],Sagenomella和Nigrospora為植物內(nèi)生菌[24-25]。而Penicillium、Mortierella、Mucor和Zopfiella等則在施磷處理中顯著升高,其中Penicillium、Mortierella和Mucor均為腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌[26-27]。上述結(jié)果表明長(zhǎng)期施用磷肥可提高土壤中腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌,降低共生和病原型真菌相對(duì)豐度。與我們的研究結(jié)果相似,Song等[10]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)21年連續(xù)施用磷肥后土壤中腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌增多,而共生的叢枝菌根真菌顯著降低。一個(gè)可能的解釋是,長(zhǎng)期施用磷肥后,作物秸稈和根系殘留物增多,土壤中的腐生營(yíng)養(yǎng)型微生物可以通過(guò)分解植物殘?bào)w獲得養(yǎng)分和能量,在土壤中具有較高的競(jìng)爭(zhēng)力。叢枝菌根真菌與植物共生生長(zhǎng),可促進(jìn)植物對(duì)土壤中礦質(zhì)養(yǎng)分(尤其是磷)的吸收,而磷肥的施用導(dǎo)致土壤養(yǎng)分(P)含量升高,植物對(duì)叢枝菌根真菌的依賴性降低,導(dǎo)致其相對(duì)豐度降低[10]；在缺磷施肥土壤中,植物秸稈和根系殘留量較少,此時(shí)腐生營(yíng)養(yǎng)型微生物由于沒(méi)有充足的外源有機(jī)物料補(bǔ)充,而失去競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),這時(shí)土壤中的植物病原菌、植物內(nèi)生菌等可以通過(guò)寄生或共生的方式通過(guò)宿主獲取養(yǎng)分和能量,從而具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。此外,Zopfiella在施磷土壤顯著升高(圖3),研究表明Zopfiella可通過(guò)分泌抗真菌化合物,抑制植物病原菌,從而控制植物病害[28]。

3.3 長(zhǎng)期施用磷肥對(duì)真菌種間關(guān)系的影響

研究對(duì)3種磷肥施用量下真菌群落進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,探索長(zhǎng)期施用磷肥對(duì)真菌群落種間關(guān)系的影響(圖4)。首先,長(zhǎng)期施用磷肥下網(wǎng)絡(luò)中子囊菌門比例逐漸增多,而擔(dān)子菌門比例逐漸減少。研究表明子囊菌門主要分解新鮮植物殘?bào)w,而擔(dān)子菌門主要分解難利用碳[29]。這種物種營(yíng)養(yǎng)習(xí)性的變化可能與土壤中C的有效性有關(guān),本研究中長(zhǎng)期施用磷肥后土壤中易利用的DOC含量顯著升高,可能導(dǎo)致子囊菌在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中比例增多。其次,隨著磷肥施用量不斷升高,真菌網(wǎng)絡(luò)連接數(shù)和平均度也隨之升高(表2),意味著施用磷肥后真菌物種之間的直接作用增多,而間接作用減少,而這種網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度的增加會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定,對(duì)外界環(huán)境變化“抵抗性”更強(qiáng)[30]。與我們的研究結(jié)果相似,Feng等[31]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用磷肥可以增加細(xì)菌物種間的關(guān)聯(lián),從而減少環(huán)境對(duì)物種篩選作用。最后,我們發(fā)現(xiàn)施用磷肥后物種之間正相關(guān)作用比例增加,而負(fù)相關(guān)作用比例減少(表2)。這可能是由于P0土壤中養(yǎng)分(尤其是TP和DOC)含量較低,各物種為爭(zhēng)奪養(yǎng)分而導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)作用增多,而施磷土壤中由于養(yǎng)分資源充足,因此各個(gè)物種間正相關(guān)比例增多。值得注意的是P1處理中正相關(guān)連接比例最高,這種正相關(guān)連接的增加有利于形成更多的營(yíng)養(yǎng)級(jí),物種之間通過(guò)資源或代謝產(chǎn)物互補(bǔ)使得養(yǎng)分利用更為高效[32]。此外隨著磷肥的施入,平均聚類系數(shù)逐漸降低,這說(shuō)明長(zhǎng)期施用磷肥增加可土壤異質(zhì)性,可滿足不同生態(tài)位真菌生長(zhǎng)；而不施磷肥土壤中較高的平均聚類系數(shù)意味著其內(nèi)物種功能的高度一致性,環(huán)境因子的篩選作用較強(qiáng),只有那些適應(yīng)缺磷條件的物種存在于網(wǎng)絡(luò)中。

前人的研究結(jié)果表明,在砂姜黑土區(qū)長(zhǎng)期施用磷肥可顯著提高砂姜黑土土壤肥力,提升地上作物產(chǎn)量[1-3]。而本研究的結(jié)果進(jìn)一步表明,長(zhǎng)期施用磷肥還可明顯改變地下真菌群落多樣性、組成和種間關(guān)系。施磷后土壤中Penicillium、Mortierella和Mucor等腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌的增多有助于土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化,Simplicillium和Magnaporthiopsis等植物病原菌的減少有助于減緩作物病害。此外磷肥施用還可提高真菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度和穩(wěn)定性。這些結(jié)果有助于我們了解地下微生物群落與土壤環(huán)境因子、地上作物之間關(guān)系。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)21年不同磷肥施用梯度后,真菌多樣性隨磷肥施用量的增多而有降低的趨勢(shì),并與土壤TP和AP成顯著負(fù)相關(guān)。磷肥施用顯著改變了真菌群落組成,而這主要與土壤養(yǎng)分(TP和DOC)的變化有關(guān)。磷肥的施用刺激腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌的生長(zhǎng),但導(dǎo)致病原型和共生/寄生型真菌相對(duì)豐度降低。此外長(zhǎng)期施用磷肥還可增加真菌群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度和穩(wěn)定性。