顏岳輝，丁雪梅，李強(qiáng)，李旭，唐利洲*

(1. 西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224； 2. 曲靖師范學(xué)院，云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，云南曲靖655011)

波氏吻蝦虎Rhinogobiuscliffordpopei隸屬于鱸形目Perciformes蝦虎魚科Gobiidae蝦虎魚亞科Gobiinae吻蝦虎魚屬Rhinogobius(Nichols，1925)，是一類小型淡水性底棲魚類，模式標(biāo)本發(fā)現(xiàn)于長江水系的洞庭湖(Nichols，1925)，隨后入侵珠江及云南的高原湖泊(伍漢霖，鐘俊生，2008；陳小勇，2013)。該物種屬中國特有種，目前廣泛分布于長江、黃河、珠江、遼河、錢塘江等水系的支流、湖泊和水庫生境中，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值(伍漢霖，鐘俊生，2008；李帆，2011)。有關(guān)該物種形態(tài)特征、行為習(xí)性、食性、繁殖、營養(yǎng)生態(tài)位、生境選擇與分化、生長和種群動態(tài)等特征已有記述(倪勇，伍漢霖，2006；伍漢霖，鐘俊生，2008；王華，郭延蜀，2009；李帆，2011；Guoetal.，2012，2013，2014，2016，2017)。波氏吻蝦虎線粒體基因組測定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析表明，其線粒體基因組全長16 511 bp，包括13個蛋白質(zhì)編碼基因，22個tRNA基因，2個rRNA基因和1個控制區(qū)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，波氏吻蝦虎形成了一個單系群，再次驗證其獨立種的分類地位(Zhongetal.，2018)。除此之外，有關(guān)波氏吻蝦虎群體遺傳學(xué)和種群生態(tài)學(xué)方面的研究工作則未見報道，尤其是涉及該物種在入侵地的遺傳多樣性水平和遺傳變異的研究較為缺乏。因此，從群體遺傳學(xué)角度探討波氏吻蝦虎在珠江源頭水體的群體遺傳多樣性和遺傳分化程度，揭示其遺傳多樣性形成過程與影響成因，可以為控制該入侵種的擴(kuò)散分布和生態(tài)危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣

珠江由西江、北江、東江和珠江三角洲等組成，西江是珠江的干流，發(fā)源于云南省曲靖市沾益區(qū)境內(nèi)的馬雄山，南盤江是西江的第一段河流。96份波氏吻蝦虎樣本采自南盤江上游的云南省曲靖市的沾益區(qū)白浪水庫(BL)、經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)面店水庫(MD)、麒麟?yún)^(qū)瀟湘(XX)、沿江(YJ)、三寶(SB)、獨木(DM)、太陽島(TYD)和漲水坡水庫(ZSP)及陸良縣響水壩(XSB) 9個自然水庫(表1，圖1)。樣本用95%乙醇固定，4 ℃保存。

1.2 基因組總DNA提取、PCR擴(kuò)增與測序

采用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的基因組DNA提取試劑盒抽提總DNA，提取方法參考試劑盒的方案。以GenBank數(shù)據(jù)庫已有波氏吻蝦虎線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因全序列(登錄號：KX898434)為參考，由昆明碩擎生物科技有限公司設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，引物序列為F： 5’-AACCACT-ACCCCAGAACCA-3’和R：5’-CTTTTCGTCATATCCGGTGCCC-3’。反應(yīng)體系為50 μL：1 μL DNA母液，2 μL上、下游引物，25 μL 2×Easy Taq PCR Supermix(TRANSGEN BIOTECH)，22 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃續(xù)延伸5 min，4 ℃保存。取1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物混合2 μL 6×Loading buffer凝膠加樣緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

圖1 波氏吻蝦虎樣本采集點Fig. 1 Sampling sites of Rhinogobius cliffordpopei

種群代碼見表1

Population code see table 1

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Chromas 2.62(Kyte & Doolittle，1982)和Seqman(Allex，1999)進(jìn)行同源排序，結(jié)合手動校對序列。運用DnaSP 5.10(Rozas & Rozas，1995)統(tǒng)計序列的多態(tài)性信息，分析種群的單倍型多樣性、核苷酸多樣性及標(biāo)準(zhǔn)差。運行MrModeltest 2.2(Darribaetal.，2012)檢驗核苷酸最適模型。以GenBank數(shù)據(jù)庫下載的吻蝦虎魚屬的子陵吻蝦虎R.giurinus(R.giurinus1：KF371534、R.giurinus2：KP892753、R.giurinus3：NC_022692)、褐吻蝦虎R.brunneus(R.brunneus1：NC_028435、R.brunneus2：KT601096、R.brunneus3：AB872439)、短吻紅斑吻蝦虎R.rubromaculatus(R.rubromaculatus1：AY137607、R.rubromaculatus2：AY137606、R.rubromaculatus3：AY137604)作為外群，利用MrBayes 3.2(Ronquist & Huelsenbeck，2003)構(gòu)建波氏吻蝦虎單倍型間的貝葉斯樹，以HKY+G為最適模型，運算1 000萬代，每100代取樣一次，去掉burn-in運算開始25%的不可信區(qū)域，直到鏈?zhǔn)諗?，即分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差小于0.01停止運算。運行MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)計算種群間和單倍型間遺傳距離，并運用最大似然法(maximum-likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。運行Network 5.0(Richardsetal.，1996)，利用中連法(median-joining method)構(gòu)建波氏吻蝦虎群體單倍型間的網(wǎng)絡(luò)圖。其次，利用Arlequin 3.5(Excoffier & Lischer，2010)的分子變異分析(AMOVA)模塊(Excoffieretal.，1992)分析群體遺傳結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性與種群動態(tài)

波氏吻蝦虎cytb基因全序列長1 141 bp，包括1 072個保守位點，69個變異位點，其中單突變位點3個，簡約信息位點66個，無插入和缺失位點。96只個體檢測出cytb單倍型5個(Hap1～Hap5，登錄號：MK204741～MK204745)，單倍型間的遺傳距離為0.001～0.064，單倍型多樣性(Hd)為0.359±0.059，核苷酸多樣性(Nd)為0.021±0.010(表2)。9個地理種群的76只個體共享單倍型Hap1，種群DM和ZSP共享單倍型Hap2、Hap3，種群YJ獨有單倍型Hap4，種群ZSP獨有單倍型Hap5(表2)。所有地理種群中，除BL、XX、MD、SB、TYD和XSB僅有1個單倍型Hap1，未分析出多樣性信息外，種群DM的Hd(0.709±0.083)和Nd(0.023±0.012)最高，種群ZSP的分別為0.561±0.154和0.017±0.009，而種群YJ的均最低，分別為0.200±0.154和0.001±0.001(表2)。種群DM、ZSP及全部群體的中性檢驗顯示，其Tajima’sD和Fu’sFs檢驗均不顯著(P>0.05)，而種群YJ的Tajima’sD為顯著性負(fù)值(P<0.05)，說明波氏吻蝦虎的DM、ZSP種群及全部群體未檢測到種群擴(kuò)張，而支持YJ種群經(jīng)歷過近期種群擴(kuò)張(表2)。

表2 珠江源頭波氏吻蝦虎種群遺傳多樣性與中性檢驗Table 2 Results of genetic diversity and neutrality test of Rhinogobius cliffordpopei at the source of the Pearl River

2.2 分子系統(tǒng)演化關(guān)系

分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的貝葉斯樹顯示，與外群子陵吻蝦虎、褐吻蝦虎和短吻紅斑吻蝦虎分開，波氏吻蝦虎的5個單倍型Hap1～Hap5以高自舉值構(gòu)成了一個獨立的單系群，驗證其獨立種分類地位(圖2)。其次，波氏吻蝦虎群體分化為 2個系統(tǒng)分支，單倍型Hap2、Hap5構(gòu)成的第一分支和單倍型Hap4、Hap1和Hap3構(gòu)成的第二分支(圖2：左)?；谧畲笏迫环?gòu)建的系統(tǒng)樹分析出與貝葉斯樹一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。同時，單倍型間網(wǎng)絡(luò)圖同樣支持波氏吻蝦虎群體分化為2個系統(tǒng)分支(圖2：右)。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

波氏吻蝦虎群體遺傳結(jié)構(gòu)AMOVA分析結(jié)果顯示(表3)，該物種整個群體種群間和種群內(nèi)的遺傳變異占總遺傳變異組分的比率分別為62.99%和37.01%，固定指數(shù)FST為0.630(P<0.01)，即種群間的遺傳變異顯著高于種群內(nèi)，說明波氏吻蝦虎群體具有顯著的遺傳分化格局。該物種全部群體的平均遺傳距離為0.014±0.002，種群DM與ZSP、YJ之間的遺傳距離分別為0.038±0.005、0.016±0.002，種群ZSP與YJ之間的遺傳距離為0.048±0.006，反映出地理種群間的遺傳差異程度較大。

3 討論

3.1 波氏吻蝦虎的種群遺傳多樣性

圖2 波氏吻蝦虎單倍型間的貝葉斯樹(左)和網(wǎng)絡(luò)圖(右)
Fig.2 The Bayesian inference tree (left) and network relationship (right) ofRhinogobiuscliffordpopeihaplotypes

左圖中分支以上的數(shù)字是貝葉斯樹的自舉值； 而最大似然樹自舉值顯示在分支的下面； 右圖中每個實心圓代表一種單倍型，實心圓大小與單倍型頻率呈正比，圓圈(mv)代表缺失單倍型，每條線條代表一步突變

In the left figure，the numbers above the branches are the bootstrap values of Bayesian inference tree； maximum-likelihood tree bootstrap values are shown under the branches； in the right figure，every solid cycle means a haplotype； the size of solid circles is proportional to haplotype frequency，the cycle (mv) represents missing haplotypes (not sampled or extinct)，every line represents one mutation step

表3 波氏吻蝦虎群體遺傳結(jié)構(gòu)的分子變異分析Table 3 The analysis of molecular variance (AMOVA) of genetic structure of Rhinogobius cliffordpopei

通過與上述物種的比較，波氏吻蝦虎群體的遺傳多樣性表現(xiàn)為低單倍型多樣性與高核苷酸多樣性，可能是該物種入侵珠江源頭9個自然水庫種群所在區(qū)域，群體的有效種群較低，隨后經(jīng)歷了地理隔離種群的再次分化和高度的遺傳瓶頸效應(yīng)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的記述，波氏吻蝦虎成為珠江源頭云南地區(qū)的入侵種，可能主要是外省隨家魚苗帶入造成的(路瑞鎖，宋豫秦，2003；伍漢霖，鐘俊生，2008；陳小勇，2013)。家魚苗的多次放養(yǎng)可能成為波氏吻蝦虎入侵云南高原湖泊和水庫自然種群的途徑，可能因入侵地新環(huán)境的選擇壓力產(chǎn)生定居的瓶頸效應(yīng)，而處于小種群狀態(tài)，而水庫大壩和水電站的修建導(dǎo)致了種群的再次隔離分化，從而出現(xiàn)了群體低單倍型多樣性與高核苷酸多樣性的特征。同時，9個自然水庫種群存在的遺傳多樣性差異表現(xiàn)為，種群DM、ZSP均為高遺傳多樣性水平，而種群YJ則為較低的遺傳多樣性，其他種群未分析出遺傳多樣性信息。上述種群所在的水庫均為飲用水或灌溉用水，筑以大壩進(jìn)行保護(hù)，且均有多次家魚苗放養(yǎng)或增殖放流的歷史。因此，由于多次隨家魚苗引入，波氏吻蝦虎的不同來源基因型個體可能在種群DM、ZSP進(jìn)行了匯合，很大程度上彌補了奠基者效應(yīng)或瓶頸效應(yīng)造成的遺傳多樣性下降，反而為種內(nèi)雜交創(chuàng)造新的單倍型或基因型提供了機(jī)會，因此2個種群保持了種群穩(wěn)定和較高的遺傳多樣性水平(施雯等，2010)。同時，可能受到了近期奠基者事件或瓶頸效應(yīng)的影響，缺乏后續(xù)有效的人為引入或不同單倍型對不同生境具有的適應(yīng)性差異，種群BL、XX、MD、SB、TYD、XSB僅保持了具有唯一單倍型個體構(gòu)成的種群，均為一個共同祖先繁衍形成的子代個體，種群YJ則出現(xiàn)了種群擴(kuò)張(Tajima’sD=-1.873，P=0.010)和新突變的積累而表現(xiàn)為低水平的遺傳多樣性，這些水庫種群很可能面臨近交衰退和種群滅絕的風(fēng)險，其入侵能力將大大降低。

3.2 波氏吻蝦虎群體的遺傳結(jié)構(gòu)

淡水魚類的生活環(huán)境因受到河流河段的限制，較容易出現(xiàn)地理隔離影響下的種群分化格局(鄭新，2016)。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和網(wǎng)絡(luò)圖表明，波氏吻蝦虎種群存在一定的分化結(jié)構(gòu)，5個單倍型分化為2支，單倍型Hap2、Hap5形成的第一分支(種群DM的3只個體和種群ZSP的10只個體構(gòu)成)，以及單倍型Hap1、Hap3、Hap4形成的第二分支(種群BL、XX、MD、YJ、SB、TYD、XSB和種群DM的8只個體、種群ZSP的2只個體構(gòu)成)。AMOVA結(jié)果證實，波氏吻蝦虎種群間的遺傳變異率顯著高于種群內(nèi)，且具有較高的遺傳分化系數(shù)。波氏吻蝦虎在珠江源頭的自然水庫群體呈現(xiàn)出顯著的遺傳分化結(jié)構(gòu)，亦有其他入侵種在入侵地表現(xiàn)出相似的遺傳結(jié)構(gòu)(劉紅艷等，2016；秦凱波等，2017)。主要原因在于波氏吻蝦虎各種群所在的自然水庫生境，均建設(shè)有蓄容作用的大壩，可能提供了入侵種群相對封閉的水域條件，阻斷了種群間的遷移擴(kuò)散路徑，種群間基因流受限，繼而產(chǎn)生了種群間的生境隔離與遺傳分化。

外來物種的適應(yīng)性進(jìn)化成為其入侵過程中的重要應(yīng)對對策，而其遺傳多樣性被一致認(rèn)為是影響外來物種適應(yīng)和進(jìn)化潛力的關(guān)鍵因素，成為影響入侵成功與否的重要因素之一(施雯等，2010)。本研究中，波氏吻蝦虎群體具有較高的遺傳多樣性水平與顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，其豐富的核苷酸多樣性來源于多次人為無意識引入而產(chǎn)生了種內(nèi)雜交，以及水利大壩修建導(dǎo)致了隔離種群的遺傳分化，可能成為該物種成功入侵珠江源頭地區(qū)的重要原因。自20世紀(jì)60年代江南四大家魚引入云南高原地區(qū)，無意識地將波氏吻蝦虎帶入了高原湖泊與水庫自然生境(路瑞鎖，宋豫秦，2003)。入侵種群定居過程中可能經(jīng)歷了奠基者事件和遺傳瓶頸效應(yīng)的嚴(yán)重影響，部分種群出現(xiàn)遺傳多樣性的降低，然而在各水庫、湖泊自然種群的人為交叉放養(yǎng)家魚苗的活動，可能將單一祖先起源的相同單倍型個體和不同來源的單倍型個體進(jìn)行了擴(kuò)散。因而，波氏吻蝦虎在不同的水庫自然種群呈現(xiàn)出遺傳差異特征，具有共同起源但適應(yīng)能力較強(qiáng)的單倍型個體入侵了所有的自然生境，有些不同來源的單倍型個體對于生境具有適應(yīng)性差異，加上某些種群(如種群DM和ZSP)因人為多次引入了不同來源的單倍型而發(fā)生了匯合。故而，部分種群共享且擁有唯一單倍型或低的遺傳多樣性，少數(shù)種群具有較高的遺傳多樣性水平和種群穩(wěn)定性，后者可能成為人為多次引種的匯合地，也可能成為波氏吻蝦虎在珠江源頭入侵的擴(kuò)散起源地(施雯等，2010；劉紅艷等，2016)。珠江上游地區(qū)存在因大量水利大壩建設(shè)形成的破碎化生境(陳艷等，2017；陳鋒等，2018)，外來物種入侵加重了生態(tài)危害。為有效保護(hù)珠江土著魚類物種多樣性與水生生物多樣性，本研究建議，應(yīng)該嚴(yán)格加強(qiáng)波氏吻蝦虎在珠江上游地區(qū)的入侵管控，采取有效措施減少因人為放養(yǎng)家魚苗和增殖放流帶來的無意識擴(kuò)散，尤其要重視針對波氏吻蝦虎遺傳多樣性較高種群的監(jiān)測和入侵防治，加強(qiáng)該物種入侵生態(tài)學(xué)的系統(tǒng)研究工作，并充分考慮在水利大壩旁設(shè)置土著魚類的洄游通道。

致謝：本研究受云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點實驗室、云南省高校云南特境內(nèi)生菌資源的開發(fā)與利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊的資助，在此一并予以感謝!