宋亮，張劍南，劉海坤，莫春橫，李娟，王亞軍

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)是細胞表面蛋白的一個大家族，由于其結(jié)構(gòu)、配體和表達組織的多樣性，是多細胞生物協(xié)調(diào)進化的主要參與者(Hellebrandetal.，2000)。GPCRs具有典型7次跨膜結(jié)構(gòu)域(Straderetal.，1995；Gether & Kobilka，1998)。細胞外刺激如神經(jīng)遞質(zhì)、激素或光可激活GPCRs，誘導GTP結(jié)合蛋白介導的細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)(Matsumotoetal.，2000)。許多GPCRs的配體尚不清楚，這些受體被稱為孤兒受體(Hellebrandetal.，2000)。GPCRs常作為藥物的靶點(Wilsonetal.，1998；Wiseetal.，2002；Vassilatisetal.，2003)，在所有使用的藥物中，50%～60%依賴GPCR發(fā)揮其效應(yīng)(Gudermannetal.，1995)。

GPR85是2000年報道的一個新GPCR亞家族中的一員，該亞家族被稱為腦部表達的超保守受體(super conserved receptor expressed in brain，SREB)家族(Matsumotoetal.，2000)。據(jù)統(tǒng)計，GPR85基因變異與精神分裂癥疾病風險有關(guān)聯(lián)(Radulescuetal.，2013)。過度表達GPR85的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出與某些精神分裂癥模型相符合的行為(Matsumotoetal.，2008)。GPR85基因敲除小鼠腦質(zhì)量顯著增加，并有記憶力增強的趨勢，表明GPR85是腦質(zhì)量的決定因素(Matsumotoetal.，2008)。也有研究表明，GPR85是成人神經(jīng)發(fā)生和相應(yīng)認知功能的負調(diào)控因子，可能與精神分裂癥以外的神經(jīng)精神狀況有關(guān)(Chenetal.，2012)。GPR85還可能與突觸后密度蛋白(PSD-95)-神經(jīng)配蛋白復合物相互關(guān)聯(lián)，對孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)產(chǎn)生影響(Fujitajimboetal.，2015)。

SREB家族受體是通過多巴胺D4受體序列相似性搜索被發(fā)現(xiàn)的(Matsumotoetal.，2000，2005)，由SREB1(GPR27)、SREB2(GPR85)、SREB3(GPR173)3個成員組成(Matsumotoetal.，2000)，三者之間有高度的氨基酸序列一致性(52%～63%)，但與其他GPCR亞家族的一致性卻低于25%(Matsumotoetal.，2005)。GPR85迄今仍是一個孤兒受體，它在哺乳動物中高度保守，在人Homosapiens、小鼠Musmusculus和大鼠Rattusnorvegicus序列中100%相同(Hellebrandetal.，2000；Jeonetal.，2002)。哺乳類GPR85與斑馬魚Daniorerio的也有94%的氨基酸序列一致性(Matsumotoetal.，2000)。這種相似度比其他GPCR更高(Yamaguchi & Brenner，1997；De Lucchinietal.，2001；Loganetal.，2003)。SREB1與SREB3在哺乳類中也高度保守，在人和嚙齒類動物中分別具有97%和99%的序列一致性(Matsumotoetal.，2005)。雖然SREB家族序列在脊椎動物中高度保守，但其同源基因在線蟲或黑腹果蠅Drosophilamelanogaster基因組序列中卻未發(fā)現(xiàn)，這表明SREB家族可能起源于脊椎動物的祖先(Matsumotoetal.，2000，2005)。

鑒于GPR85在非哺乳類脊椎動物類群尤其是鳥類中的研究尚屬空白，因此，本研究以家雞Gallusgallusdomesticus為模型動物，克隆家雞GPR85基因的全長cDNA序列，并揭示其結(jié)構(gòu)，同時對GPR85基因在家雞各組織中的表達情況進行探究。以揭示GPR85在鳥類與哺乳類中的功能異同，尋找家雞GPR85的內(nèi)源性配體以及探究其在家雞組織中的生理作用奠定基礎(chǔ)，也為GPR85在哺乳類中的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

購自四川牧星養(yǎng)雞場的羅曼粉性成熟的公雞、母雞各3只；購自美國Molecular Research Center公司的RNA提取所用的RNAzol；購自日本TOYOBO公司的高保真KOD-FX DNA聚合酶、10×A-attachment Mix、pTA2載體；購自TaKaRa公司的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Easy-Taq DNA聚合酶、dNTPs、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶等；購自Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit；本實驗室制備保存大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞；購自生工生物工程(上海)股份有限公司的DNA 純化膠回收試劑盒；由成都擎科公司完成引物合成、DNA測序；購自Bio-Rad公司的PCR儀(S1000 Thermal Cycler)、熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)、熒光染料EvaGreen、96孔熒光定量PCR板、塑料封膜等。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA提取取家雞全腦、端腦、中腦、小腦、后腦、下丘腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、皮膚、肌肉、脂肪、胰腺、十二指腸、腎上腺、卵巢、精巢等組織于液氮中充分研磨，取約60 mg組織于1.5 mL EP管中，立即加入600 μL的RNAzol用勻漿器勻漿，冰上放置10 min后，加入240 μL的DEPC-H2O，劇烈渦旋15 s，放置15 min，12 000 r·min-1離心10 min，取700 μL上清液，加入3.5 μL的4-溴苯甲醚，劇烈渦旋15 s，放置5 min，12 000 r·min-1離心10 min，小心快速取600 μL上清液，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，放置20 min，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入600 μL 75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗滌沉淀，4 000 r·min-1離心3 min，棄上清，室溫放置晾干，加入30 μL DEPC-H2O使RNA充分溶解。

1.2.2 cDNA模板制備以家雞各組織總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA模板。取各組織總RNA 2 μg，Oligo-dT 1 μL，DEPC-H2O補足至5 μL，70 ℃加熱10 min，取出后冰浴2 min，然后加入5×緩沖液2 μL，dNTPs 0.5 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1) 0.5 μL，DEPC-H2O 2 μL，放入PCR儀中42 ℃孵育1.5 h，70 ℃加熱10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用DEPC-H2O稀釋至60 μL作為cDNA模板。

1.2.3 引物設(shè)計依據(jù)NCBI預測的家雞GPR85基因mRNA序列(GenBank登錄號：XM_004937542)和已知的β-actin基因mRNA序列，設(shè)計特異性引物用于擴增cDNA序列或檢測其組織表達。利用克隆得到的GPR85基因編碼區(qū)序列，設(shè)計家雞GPR85基因5’和3’-RACE引物(表1)。

表1 本實驗所用引物序列Table 1 Primers used in the study

注： 下劃線表示引物設(shè)計時添加的限制性內(nèi)切酶酶切位點

Note： Restriction sites added at the 5’-end of the primers are underlined

1.2.4 家雞GPR85基因編碼區(qū)的克隆以家雞全腦cDNA為模板，按照KOD FX高保真DNA聚合酶(TOYOBO)的說明書配制PCR反應(yīng)體系，PCR條件為：94 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，36個循環(huán)；最后68 ℃延伸20 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用DNA純化試劑盒回收產(chǎn)物，之后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后連接到pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen)后克隆測序。

1.2.5 家雞GPR85基因5’-RACE和3’-RACE按照SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)說明書構(gòu)建家雞全腦組織5’或3’-RACE模板，之后利用基因特異性引物PCR擴增GPR85基因的5’-UTR和3’-UTR，具體反應(yīng)體系及方法參考鄧秋洋等(2018)，第一輪PCR反應(yīng)條件為：94 ℃2 min；94 ℃10 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃10 s，70 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃10 s，68 ℃ 3 min，25個循環(huán)；最后68 ℃ 10 min，取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋 500倍作為模板，進行第二輪巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件同上。巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)加A反應(yīng)后連接至pTA2載體，克隆后進行序列測定。

1.2.6 生物信息學分析使用DNAMAN和APE進行DNA序列分析和蛋白質(zhì)翻譯；使用BioEdit和DNAMAN進行蛋白質(zhì)序列比對；使用TMpred(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預測；使用Genomicus(http：//www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-91.01/cgi-bin/search.pl)進行基因共線性分析；序列分析使用在線數(shù)據(jù)庫GenBank(http：//www.ncbi.nih.gov)和Ensembl(http：//www.ensembl.org)。

1.2.7 家雞GPR85基因的表達特征每只家雞取19個組織，針對6只家雞不同組織的cDNA模板，通過qPCR方法檢測GPR85基因的表達特征，具體方法參考黃思邈等(2015)和祝國強等(2017)。qPCR反應(yīng)擴增體系如下：cDNA模板6 μL，MilliQ-H2O 9.7 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs 0.4 μL，上、下游引物各0.3 μL，熒光染料EvaGreen 1 μL，Easy-Taq酶0.3 μL，總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃2 min；94 ℃20 s，62 ℃15 s，72 ℃20 s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCT法計算GPR85基因的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 家雞GPR85基因的克隆與序列分析

以家雞腦組織cDNA為模板，采用引物(GPR85-U+L)擴增GPR85基因編碼區(qū)，得到長度約為1 100 bp的條帶(圖1)，與預期一致。測序結(jié)果顯示，家雞GPR85基因(GenBank登錄號：MH293604)的編碼區(qū)長為1 113 bp，可編碼370個氨基酸。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，家雞GPR85蛋白具有經(jīng)典的7次跨膜區(qū)，且第三胞內(nèi)環(huán)相對較長(圖2)。家雞GPR85與人(99.73%)、小鼠(99.73%)、大鼠(99.73%)、熱帶爪蟾Xenopustropicalis(99.19%)、斑馬魚(93.80%)GPR85的氨基酸序列一致性極高。人、小鼠、大鼠GPR85的氨基酸序列完全相同，家雞GPR85的氨基酸序列與它們僅有1個氨基酸的差別，即第一胞外環(huán)中的蘇氨酸(Thr)與天冬酰胺(Asn)之差。將家雞GPR85基因編碼區(qū)cDNA序列與家雞基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因位于家雞第1號染色體上，通過染色體共線性分析，發(fā)現(xiàn)家雞GPR85基因與人、小鼠、大鼠、斑馬魚GPR85基因為直系同源基因(圖3)，表明GPR85基因在不同脊椎動物中保守存在。

圖1 家雞GPR85基因編碼區(qū)的PCR 擴增Fig. 1 PCR amplification of the coding region of chicken GPR85

2.2 家雞GPR85基因5’-UTR和3’-UTR的鑒定

以家雞全腦cDNA為模板，通過5’和3’-RACE成功獲得家雞GPR85基因的5’-UTR(389 bp)和3’-UTR序列(1 407 bp)，通過與家雞基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)家雞GPR85基因由2個外顯子構(gòu)成，第1個外顯子的長度為214 bp，第2個外顯子的長度為2 695 bp，編碼區(qū)位于第2個外顯子上，2個外顯子之間有1個長為1 508 bp的內(nèi)含子(圖4，圖5)。

2.3 家雞GPR85基因的組織表達分析

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，家雞GPR85基因mRNA在全腦、垂體、腎上腺、精巢中相對高表達，而在其他外周組織中表達水平低(圖6：A)。此外，還檢測了GPR85基因在腦各區(qū)域的表達情況，發(fā)現(xiàn)GPR85基因mRNA在家雞端腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦中均有表達，其中小腦表達水平最高(圖6：B)。

圖2 家雞GPR85(cGPR85)與人(hGPR85)、小鼠(mGPR85)、大鼠(rGPR85)、熱帶爪蟾(fGPR85)和斑馬魚(zfGPR85)的氨基酸序列比對Fig. 2 Amino acid sequence alignment of chicken GPR85 (cGPR85) with that of Homo sapiens (hGPR85)，Mus musculus (mGPR85)，Rattus norvegicus (rGPR85)，Xenopus tropicalis (fGPR85) and Danio rerio (zfGPR85)

陰影表示7次跨膜區(qū)(TM)

The putative 7 transmembrane domains (TMs) were shaded

圖3 GPR85基因在家雞、人、小鼠、大鼠和斑馬魚中的染色體共線性分析Fig. 3 Synteny analysis of GPR85 gene inGallus gallus domesticus，Homo sapiens，Mus musculus，Rattus norvegicus and Danio rerio

Chr.染色體chromosome

圖4 家雞GPR85基因結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of chicken GPR85 gene

3 討論

GPCR可參與眾多生理過程調(diào)節(jié)，如有絲分裂、肌肉收縮、離子通道調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄等(Alexanderetal.，2015)。GPR85作為孤兒受體之一，據(jù)報道在哺乳動物中高度保守(Hellebrandetal.，2000；Jeonetal.，2002)，但其在非哺乳類脊椎動物中的研究幾屬空白。本研究以家雞為模型，首次從家雞腦組織中成功克隆到GPR85基因的全長cDNA序列，揭示其基因結(jié)構(gòu)，探究其在家雞不同組織中的表達特征。

圖5 家雞GPR85基因全長cDNA序列和氨基酸序列Fig. 5 The full-length cDNA sequence and amino acid sequence of chicken GPR85 gene

箭頭示內(nèi)含子位置，星號(＊)示終止密碼子TGA

Arrowhead indicates the location of intron 1 and asterisk denotes the stop codon (TGA)

圖6 實時熒光定量PCR分析家雞GPR85基因的組織表達特征Fig. 6 Quantitative real-time PCR assay of GPR85 gene expression in chicken tissues

(A) Br. 全腦，Pi. 垂體，He. 心臟，Li. 肝臟，Sp. 脾臟，Lu. 肺，Ki. 腎臟，Sk. 皮膚，Mu. 肌肉，F(xiàn)at. 脂肪，Pa. 胰腺，Du. 十二指腸，Adr. 腎上腺，Ov. 卵巢，Te. 精巢； (B) Tc. 端腦，Mb. 中腦，Cb. 小腦，Hb. 后腦，Hp. 下丘腦； 以β-actin基因作為內(nèi)參，GPR85基因的相對表達水平以倍數(shù)形式表示(以全腦或者端腦為對照)

(A) Br.whole brain，Pi. pituitary，He. heart，Li. liver，Sp. spleen，Lu. lung，Ki. kidney，Sk. skin，Mu. muscle，F(xiàn)at. fat，Pa. pancreas，Du. duodenum，Adr. adrenal gland，Ov. ovary，Te. testis； (B) Tc. telencephalon，Mb. midbrain； Cb. cerebellum，Hb. hindbrain，Hp. hypothalamus； the mRNA level ofGPR85gene was normalized to that ofβ-actinand expressed as fold difference compared with that of whole brain or telencephalon

本研究首次從全腦組織中成功克隆到家雞GPR85基因的完整編碼區(qū)序列，其編碼1個長度為370個氨基酸的具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的受體蛋白。序列分析顯示家雞GPR85與人(99.73%)、小鼠(99.73%)、大鼠(99.73%)、熱帶爪蟾(99.19%)、斑馬魚(93.80%)GPR85的氨基酸序列一致性極高。人、小鼠、大鼠的GPR85的氨基酸序列完全相同，家雞GPR85的氨基酸序列與它們僅有1個氨基酸的差別。共線性分析發(fā)現(xiàn)，家雞GPR85基因位于家雞第1號染色體上，與人、小鼠、大鼠、斑馬魚GPR85為直系同源基因。由于在非脊椎動物線蟲或黑腹果蠅基因組序列中未發(fā)現(xiàn)GPR85同源基因(Matsumotoetal.，2000)，這表明GPR85基因可能僅在脊椎動物中發(fā)揮重要生理功能。

利用RACE技術(shù)成功獲得了家雞GPR85基因的5’-UTR和3’-UTR序列。家雞GPR85基因的5’-UTR和 3’-UTR序列均與NCBI中預測的GPR85基因序列存在長度上的差異。本研究發(fā)現(xiàn)家雞GPR85基因具有較長的3’-UTR序列(1 407 bp)，暗示其可能參與GPR85mRNA的穩(wěn)定性、亞細胞定位及翻譯的調(diào)節(jié)。利用實時熒光定量PCR方法，獲得了家雞GPR85基因的組織表達圖譜，發(fā)現(xiàn)其在全腦(包括端腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦)、垂體、腎上腺、精巢中高表達，而在其他組織中具有較低的表達水平。家雞GPR85基因在腦中的高表達與哺乳動物GPR85基因在腦中的表達情況相似，暗示GPR85同樣也在家雞腦的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(Matsumotoetal.，2000，2005)。家雞GPR85基因在精巢中的高表達也與哺乳動物高度一致(Matsumotoetal.，2000)，暗示其在精巢中的功能存在一定保守性。而在哺乳動物中，尚未有GPR85基因在垂體中高表達的報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)GPR85基因在垂體組織中的高水平表達，亦暗示其可能參與調(diào)控垂體激素的合成與分泌等。

綜上，本研究首次在非哺乳類脊椎動物物種(家雞)中，揭示家雞GPR85基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，并發(fā)現(xiàn)其在全腦、垂體、精巢和腎上腺中高表達。家雞和哺乳動物GPR85基因結(jié)構(gòu)和組織表達的高度保守性，提示GPR85在脊椎動物腦、精巢等組織中發(fā)揮關(guān)鍵生理作用，值得深入探究。