吳 勛，孟祥磊，譚 朋，王立改，樓 寶

（1.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021；2.嵊泗縣海洋與漁業(yè)局，浙江嵊泗 202450）

魚油是海水魚類配合飼料的優(yōu)質(zhì)脂肪源，但水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展使得有限的魚油資源不能滿足水產(chǎn)飼料工業(yè)的需要。植物油（如豆油）因具有來源廣、產(chǎn)量大、價格低、富含多不飽和脂肪酸等優(yōu)點，是首選的魚油替代脂肪源。然而，飼料中過高比例植物油會導致海水魚類肝臟組織結(jié)構(gòu)病變、炎癥水平升高等問題[1-4]，限制了植物油在水產(chǎn)動物飼料中的使用。因此，有必要開展飼料中植物油替代魚油對肝臟炎癥機制的研究，為降低乃至消除飼料中植物油造成的魚類健康問題提供理論依據(jù)，以期實現(xiàn)節(jié)約魚油資源和保護魚體健康的目的。

黃姑魚Nibea albiflora Richardson是我國東海特有的經(jīng)濟魚類，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，在國內(nèi)外市場受到廣泛歡迎。隨著黃姑魚生物學特性、遺傳育種、養(yǎng)殖技術和飼料開發(fā)等研究的深入，黃姑魚已成為我國東海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖品種。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃姑魚人工配合飼料中n-3LC-PUFA需要量約1%，豆油完全替代黃姑魚飼料中魚油會引起肝臟脂肪沉積和組織病變。因此，為了降低黃姑魚配合飼料中魚油使用量，有必要開展豆油對黃姑魚肝臟免疫機制的研究。以往魚類中的研究主要采用養(yǎng)殖實驗的方式，即通過在飼料中添加不同水平（或種類）植物油，研究飼料中植物油對魚體免疫機制的研究。然而，養(yǎng)殖實驗普遍存在實驗周期長、價格昂貴以及干擾因素多等問題，阻礙了魚類脂肪酸免疫研究的進展。離體實驗部分彌補了養(yǎng)殖實驗的缺點，具有試驗周期短和結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，對于研究不同脂肪酸對魚類肝臟炎癥的機制研究具有重要補充作用[5]。

飼料中植物油替代魚油的本質(zhì)是脂肪酸的替代。豆油作為海水經(jīng)濟魚類飼料中最常用的植物油，其主要成分是亞油酸；魚油中重要的抗炎脂肪酸是Omega3系列的二十碳五烯酸（EPA）。本實驗擬通過LPS刺激模擬外界環(huán)境脅迫，通過比較亞油酸和二十碳五烯酸在黃姑魚肝臟細胞炎癥相關基因的表達，以期揭示豆油替代飼料中魚油對黃姑魚導致的炎癥反應的機制，進而實現(xiàn)飼料中植物油“精準替代”飼料中魚油。

1 材料方法

1.1 黃姑魚原代肝臟組織細胞的培養(yǎng)

1.1.1 培養(yǎng)基的制備

基礎培養(yǎng)基（100 mL）：DMEM/F12 液體培養(yǎng)基（Hyclone，美國）99 mL、100×青鏈霉素溶液（Thermo Scientific，美國）1 mL，用 NaOH 溶液（1 M，Sigma，美國）調(diào)節(jié) pH=7.2～7.4。

完全培養(yǎng)基（100 mL）含有：DMEM/F12 液體培養(yǎng)基 83 mL、100×青鏈霉素溶液 1 mL、200 mmol·L-1L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Thermo Scientific，美國）1 mL 和胎牛血清（Thermo Scientific，美國）15 mL，用 NaOH 溶液（1 M，Sigma，美國）調(diào)節(jié) pH=7.2～7.4。

1.1.2 肝臟組織原代細胞培養(yǎng)

選取體重約為20～30 g的健康黃姑魚幼魚，用含1 000 IU·mL-1青霉素和1 000 μg·mL-1鏈霉素的無菌海水暫養(yǎng)實驗魚10 h。將實驗魚用抄網(wǎng)撈出，用MS222（Sigma，美國）麻醉，剪斷鰓放血。在滅菌培養(yǎng)皿中用碘伏（1%）擦拭3次，后轉(zhuǎn)移至超凈臺中用70%酒精擦拭3次；在滅菌紗布上用解剖工具解剖試驗魚并無菌分離肝臟組織。

將分離得到的肝臟組織用鑷子夾取，置于70%酒精中涮洗15 s后在裝有PBS的青霉素小瓶中涮洗2次，再用基礎培養(yǎng)基清洗2次，以清洗肝臟組織塊表面的血漬和其他雜質(zhì)，最后暫存于完全培養(yǎng)基中。

用眼科剪將肝臟組織剪成1 mm3的組織塊，其間不斷用基礎培養(yǎng)基沖洗，直至澄清；清洗的目的在于去除肝臟中的血細胞和脂肪等雜質(zhì)。室溫下，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶（Thermo Scientific，美國）消化組織塊10 min后用含有胎牛血清的培養(yǎng)基中和。將組織塊轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，600 r·min-1離心5 min，棄上清，重復3次，每次加入完全培養(yǎng)基重懸。分離得到的肝臟組織細胞使用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并用完全培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整到1×106mL-1。在6孔板中（Corning，美國）按照每孔2×106細胞數(shù)進行接種。接種后將細胞培養(yǎng)板置于28℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每48 h更換培養(yǎng)液的50%。

1.2 脂肪酸-牛血清白蛋白溶液的配制

二十碳五烯酸和亞油酸均購自Sigma-Aldrich，美國。主要參照李慶飛[6]的方法進行配制。

1.2.1 牛血清白蛋白溶液的配制

電子天平準確稱取10.0 g不含脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）粉末（Equitech-Bio，美國），加入到493 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中（Thermo Scientific，美國），再加入100×青霉素鏈霉素溶液5 mL和10 mM VE醋酸酯1 mL。使用Nalgene 566-0020一次性無菌過濾裝置（Thermo Scientific，美國）將BSA溶液過濾除菌，分裝后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二十碳五烯酸（EPA）-牛血清白蛋白復合物（EPA-BSA）的配制

加2 mL無水乙醇（國藥，中國）到100 mg EPA中，用移液器吸取其中的1/10加入至EP管中，氮氣吹干，加入0.1 mL氫氧化鈉溶液（1 M，Sigma，美國），輕彈混勻，使之皂化。將皂化的EPA完全轉(zhuǎn)移到體積為33.1 mL的BSA（2%，含20 μM VE醋酸酯）溶液中，超聲波作用5 min，0.22 μm一次性無菌過濾即配置成1 mM的EPA-BSA母液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。實驗開始前，將母液用2%BSA溶液稀釋到需要濃度并在培養(yǎng)箱中預熱30 min。

1.2.3 亞油酸（LNA）-牛血清白蛋白復合物（LNA-BSA）的配制

方法同DHA-牛血清白蛋白復合物（DHA-BSA）的配制，不同的是BSA溶液的體積為35.7 mL。

1.3 黃姑魚肝臟細胞免疫刺激

LPS（lipopolysaccharide，分離自大腸桿菌，0111：B4，Sigma-Aldrich，美國）使用之前用 DMEM/F12 培養(yǎng)基稀釋至100 mg·mL-1，用0.22 μm濾膜（Millpore，美國）過濾除菌后制成LPS母液，儲存于-20℃冰箱中。使用前用完全培養(yǎng)基將LPS母液配成0、0.1、1.0和10.0 mg·mL-1的應用液。其中LPS濃度為0的應用液含有 1 μL·mL-1的 DMSO 溶液。

啟動原代培養(yǎng)后7 d，將細胞培養(yǎng)板中黃姑魚肝臟細胞使用胰酶消化到新的培養(yǎng)板中（1.0×107/孔）待細胞在培養(yǎng)板中貼壁后去掉原有培養(yǎng)基，分別加入2.5 mL濃度為0、0.1、1.0和10.0 mg·mL-1的LPS應用液孵育4 h后收集黃姑魚肝臟細胞樣本，每個處理4個重復。

1.4 黃姑魚肝臟細胞脂肪酸孵育

啟動原代培養(yǎng)后7 d，將細胞培養(yǎng)板中黃姑魚肝臟細胞使用胰酶消化到新的培養(yǎng)板中（1.0×107/孔），待細胞在培養(yǎng)板中貼壁后去掉原有培養(yǎng)基，分別加入2.5 mLBSA溶液（對照）、0.1 mM二十碳五烯酸（EPA）-牛血清白蛋白復合物（EPA-BSA）、0.1 mM亞油酸-牛血清白蛋白復合物（LNA-BSA）孵育6 h；除掉培養(yǎng)基，加入含有1.0 mg·mL-1LPS的完全培養(yǎng)基。每個處理4個重復。免疫刺激4 h后收集黃姑魚肝臟細胞樣本。

1.5 細胞收集、總RNA提取、cDNA合成和熒光定量PCR

去除6孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次，將0.3 mL/孔Trizol試劑（Takara，中國）加入板中，移液器吹打消化貼壁細胞。按照說明書提供的方法提取組織總RNA。為除去基因組DNA，提取的總RNA使用RNase-Free DNase（Takara，中國）處理。RNA的完整性使用1.2%的變性瓊脂糖凝膠來鑒定?？俁NA采用Nano Drop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）定量?？俁NA的260/280 nm吸光度滿足1.8～2.0方可進行下一步反轉(zhuǎn)錄實驗。提取的RNA按照說明書使用Primer Script TM RT reagent Kit（Takara，中國）反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

實時定量PCR按照之前實驗方法進行[7]。PCR反應使用熒光試劑為SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，中國），反應條件為：預變性95℃10 min，一個循環(huán)；變性95℃15 s，引物退火56～60℃15 s，引物延伸68℃30 s，40 個循環(huán)。溶解曲線：95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。檢測 TLR2、TLR3、TLR22、MyD88、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOCS3和β-actin基因的表達量，其中β-actin是內(nèi)參基因。每個樣本包含3個技術重復，結(jié)果取平均值作為該樣本的最終數(shù)值。實驗使用轉(zhuǎn)錄組序列進行設計（表1）。計算基因相對表達量采用2-△△CT法[8]。

表1 實驗中用到的熒光定量引物序列Tab.1 Primers used in this study for qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPASS20.0（SPASS，Inc.，美國）進行數(shù)據(jù)分析。在處理脂肪酸對黃姑魚肝臟組織細胞炎癥基因表達的研究數(shù)據(jù)時采用單因素方差分析的方法，并進行Turkey檢驗。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤的形式呈現(xiàn)，P＜0.05表示存在顯著差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 黃姑魚肝臟細胞培養(yǎng)觀察

黃姑魚肝臟細胞原代培養(yǎng)啟動后72 h，絕大部分細胞貼于瓶底，僅有少量漂浮在培養(yǎng)液中，細胞呈梭形細胞（圖1a）；原代培養(yǎng)啟動后7 d，大部分細胞呈多邊形和梭形，細胞折光性良好，形狀均一，生長狀態(tài)良好，匯合率達到80%，臺盼藍染色法鏡檢其存活率≥95%（圖1b）。

圖1 黃姑魚肝臟組織細胞光鏡照片F(xiàn)ig.1 Light microphotograph for N.albiflora liver cells

2.2 LPS濃度對黃姑魚肝臟細胞TNF-α和IL-1β基因表達的影響

實驗發(fā)現(xiàn)：LPS 刺激黃姑魚肝臟細胞 4 h 后相對 0 mg·mL-1（DMSO）組，0.1、1.0 和 10.0 mg·mL-1的 LPS 均可顯著升高TNF-α和IL-1β基因表達量（P＜0.05），TNF-α和IL-1β基因表達量隨著LPS濃度降低而降低（圖2）。

2.3 EPA和LNA在黃姑魚肝臟細胞中抑制LPS誘導的炎癥效果的比較

以BSA組為對照組，分別用EPA和LNA（濃度為0.1 mM）孵育黃姑魚肝臟組織細胞6 h，而后用1.0 mg·mL-1LPS刺激黃姑魚肝臟組織細胞4 h，發(fā)現(xiàn)與LNA組相比，EPA顯著降低促炎癥基因TLR2、TLR22、MyD88、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表達量（P＜0.05）（圖 3）。這表明，黃姑魚原代肝臟細胞模型可用于營養(yǎng)免疫研究，相同濃度的EPA相對于LNA在黃姑魚肝臟細胞中有更強的抑炎效果。

圖2 LPS誘導的黃姑魚肝臟組織細胞促炎癥基因的表達Fig.2 Pro-inflammatory genes response to different dose LPS in N.albiflora liver cells

圖3 EPA和LNA孵育對黃姑魚肝臟細胞炎癥相關基因表達的影響Fig.3 Response of immune-related gene to EPA and LNA in N.albiflora liver cells

3 討論

魚油是水產(chǎn)動物飼料優(yōu)質(zhì)的脂肪源，但有限的資源和高昂的價格已經(jīng)不能滿足水產(chǎn)飼料工業(yè)的發(fā)展，尋找合適的魚油替代脂肪源是水產(chǎn)動物脂類營養(yǎng)的熱點話題。豆油是我國產(chǎn)量最大的植物油，也是在水產(chǎn)動物飼料中應用最廣泛魚油替代脂肪源。然而，飼料中過高比例豆油替代魚油會導致魚體炎癥反應發(fā)生，進而降低魚體免疫力和抗病力[9]。以往的研究主要通過制備豆油不同比例替代魚油的飼料探究豆油對魚類免疫的影響，但是養(yǎng)殖溫度和溶氧等物理和化學因素均會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。針對這一問題，本實驗采用離體實驗的方法，研究魚油中重要脂肪酸二十碳五烯酸（EPA）和豆油中主要脂肪酸亞油酸（LNA）對黃姑魚肝臟細胞免疫的影響，擬從離體實驗角度揭示豆油引起肝臟炎癥反應的機制，從而為緩解乃至解決豆油替代魚油引起的炎癥反應提供理論基礎。

本研究首先探究了黃姑魚肝臟細胞的培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)0.25%胰酶酶解的方法可以在1周左右完成黃姑魚原代肝臟細胞培養(yǎng)。經(jīng)過一周培養(yǎng)，大部分肝臟細胞呈多邊形和梭形，細胞折光性良好，形狀均一，生長狀態(tài)良好，匯合率達到80%，臺盼藍染色法鏡檢其存活率≥95%（圖1）。為了模擬水生環(huán)境中普遍存在的重金屬、氧自由基和病原體等脅迫因素，本實驗采用LPS刺激黃姑魚肝臟細胞。LPS可直接刺激細胞的病原模式分子識別受體（如TLRs）將信號傳遞到細胞內(nèi)，進而通過信號級聯(lián)反應（如NF-kB信號通路）產(chǎn)生炎癥因子；NF-kB作為轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到細胞核DNA上，啟動促炎癥因子諸如TNF-α和IL-1β等促炎癥基因的表達[10]。實驗中發(fā)現(xiàn)0.1、1.0和10.0 mg·mL-1的LPS均可刺激細胞中TNF-α和IL-1β基因表達（圖2）。此外，在安大略鮭Salmo salar[11]、藍鰭金槍魚Thunnus maccoyii[12]和大西洋鱈Gadus morhua[13]等離體實驗中亦發(fā)現(xiàn)LPS可以刺激炎癥相關基因的表達。因此，本實驗發(fā)現(xiàn)LPS可刺激黃姑魚肝臟細胞，導致其炎癥發(fā)生。

植物油替代魚油的本質(zhì)是脂肪酸的替代，豆油替代魚油導致飼料中LNA含量的升高以及Omega3脂肪酸（如EPA）含量的降低。本實驗中發(fā)現(xiàn)，EPA較LNA和BSA顯著降低了促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達量，這可能與EPA抑制TLRs有關。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Omega3 LC-PUFA可以通過抑制TLR4-MyD88介導NF-kB信號通路的激活進而抑制促炎癥因子的產(chǎn)生[14-15]。此外，Omega3 LC-PUFA還可以直接影響NF-kB通路配體IκB的磷酸化，直接抑制促炎癥基因的轉(zhuǎn)錄[16]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPA顯著降低了TLR2和TLR22（魚類特有）以及接頭分子MyD88基因的表達，這與花鱸中的結(jié)果類似[17]。

本實驗通建立黃姑魚肝臟離體細胞模型，發(fā)現(xiàn)其對LPS存在免疫響應，有效模擬了自然條件下金屬、氧自由基和病原體等脅迫因素；分別將魚油代表性脂肪酸EPA和豆油代表性脂肪酸與BSA形成復合物，孵育肝臟細胞，模擬在體條件下魚油和豆油飼料，研究豆油導致肝臟炎癥的原因，發(fā)現(xiàn)其可能是通過影響TLRs-NF-kB信號通路實現(xiàn)的。本實驗的開展為研究黃姑魚人工配合飼料植物油替代魚油引起的炎癥反應提供了新思路，這將為降低乃至消除飼料中植物油造成的魚類健康問題提供理論依據(jù)，進而實現(xiàn)節(jié)約魚油資源和保護魚體健康的目的。

4 結(jié)論

（1）本研究建立的黃姑魚原代肝臟細胞模型可用于營養(yǎng)免疫研究；

（2）1.0 mg·mL-1的LPS刺激下，黃姑魚肝臟細胞中0.1 mM的EPA相比LNA有更強的抑炎效果。