吳維顥 余蓮 陳隆天 黃建清 賴勤 賀俊波 黃新珠 鄒翠云 江福能

【摘要】目的 檢測福建省龍巖市地中海貧血（地貧）患者可能攜帶的α珠蛋白基因和β珠蛋白基因新位點突變。方法 選擇福建省龍巖市地貧篩查陽性的15例患者，采用跨越裂口PCR法檢測--SEA、-α3.7和-α4.2 3種缺失型突變，PCR擴增α珠蛋白基因和β珠蛋白基因，Sanger測序檢測純化的PCR產(chǎn)物的序列，并且將感興趣的標(biāo)本用毛細管電泳技術(shù)檢測血紅蛋白的類型及占比。結(jié)果 共檢測到10種新位點突變，分別為HBA1： codon 14 TGG> TGA、HBA1： IVS-I-65A> G、HBA1： codon 139 AAA> ATA、HBA2： -43 G> C、HBA2： c.*136A> G、HBB： -99 G> A、HBB： -96 G> A、HBB： -62 G> A、HBB： c.56 C> T和HBB： 3UTR +133 G> C。15例地貧患者中有4例為HBA1： codon 14 TGG> TGA攜帶者。結(jié)論 研究發(fā)現(xiàn)了10種珠蛋白基因的新位點突變，豐富了珠蛋白基因突變數(shù)據(jù)庫。HBA1： codon 14 TGG>TGA在福建省龍巖市人群中可能是常見的α地貧位點突變，有必要進行大樣本檢測確定HBA1： codon 14 TGG>TGA在該地區(qū)地貧患者中的攜帶率。

【關(guān)鍵詞】地中海貧血;新位點突變;HBA1： codon 14 TGG>TGA;攜帶率

【Abstract】Objective To detect the new point mutations of hemoglobin subunit alpha and beta genes probably carried by thalassemia patients from Longyan， Fujian Province in China.? Methods Fifteen patients positive for thalassemia from Longyan， Fujian Province were recruited in this study. Three deletion mutants of -- SEA， -α3.7 and -α4.2 were detected by the gap PCR. The hemoglobin subunit alpha and beta genes of thalassemia patients was amplified by PCR. The sequence of the purified PCR products was analyzed by Sanger sequencing. The hemoglobin type and proportion of interested samples were analyzed by capillary electrophoresis.? Results Ten new point mutations of hemoglobin genes were found including HBA1： codon 14 TGG > TGA， HBA1： IVS-I-65 A > G， HBA1： codon 139 AAA > ATA， HBA2： -43 G > C， HBA2： c.*136 A >G， HBB： -99 G >A， HBB： -96 G > A， HBB： -62 G> A， HBB： c.56 C > T and HBB： 3UTR +133 G > C. Four of the 15 thalassemia patients were HBA1： codon 14 TGG > TGA carriers.? Conclusions Ten new point mutations of hemoglobin genes are detected， which enrich the hemoglobin gene mutation database. HBA1： codon 14 TGG>TGA may be a common alpha-thalassemia mutation in the population of Longyan， Fujian Province. Subsequent investigations with large sample size are urgently required to determine the carrying rate of HBA1： codon 14 TGG > TGA in thalassemia patients from this area.

【Key words】Thalassemia;New point mutation;HBA1： codon 14 TGG>TGA;Carrying rate

地中海貧血（地貧）是一種嚴重威脅人類健康的遺傳性溶血疾病，由珠蛋白基因的缺失或者位點突變造成[1-2]。地貧分為α型、β型、δβ型和δ型，其中以α和β地貧較為常見。血紅蛋白由珠蛋白和血紅素組成，含有4條多肽鏈，每條多肽鏈含有1個血紅素基團。組成珠蛋白的肽鏈有4種，即α、β、γ、δ鏈。α珠蛋白由α1珠蛋白基因HBA1和α2珠蛋白基因HBA2編碼，β珠蛋白由β珠蛋白基因（HBB）編碼，γ珠蛋白由HBG1和HBG2基因編碼，δ珠蛋白由HBD基因編碼。血紅蛋白具有多種類型，包括血紅蛋白A（HbA，α2β2）、血紅蛋白A2（HbA2，α2δ2）、血紅蛋白F（HbF、α2γ2）、血紅蛋白H（HbH、β4）、血紅蛋白HbBarts（γ4）。福建省龍巖市是地貧的高發(fā)地區(qū)，本研究將對該地區(qū)地貧患者的α珠蛋白基因和β珠蛋白基因進行測序檢測，進一步了解突變類型及分布，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選擇福建省龍巖市15例地貧篩查陽性患者，其紅細胞平均體積（MCV）< 80 fl和 （或） 紅細胞平均血紅蛋白含量（MCH）< 27 pg。15例地貧患者男6例、女9例，年齡11 ～ 71歲、中位年齡41歲，均非同一家系。所有受試者或其家屬已簽署知情同意書，本研究已通過福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

二、方 法

1. 主要試劑

包括：HiPure Tissue DNA Mini Kit（美基生物），瓊脂糖（西班牙Biowest），EB （上海阿拉丁生化科技有限公司），2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司），根據(jù)人類11號染色體的序列（NC_000011.10）和16號染色體的序列（NC_000016.10）設(shè)計的引物由蘇州鴻迅生物科技有限公司合成，其序列見表1。

2. 主要儀器

包括：XS-800i全自動血液分析儀（日本SYSMEX株式會社），Nano-300微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司），Powerpac Basic電泳儀（美國Bio-RAD），Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），A100PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），CAPILLARYS2全自動毛細管電泳儀（法國Sebia）。

3. 標(biāo)本采集

采集每例地貧篩查陽性患者的外周血約5 ml，

置于BD K2EDTA常規(guī)采血管（BD Becton，367856）備用。

4. 血常規(guī)分析

將2 ml外周血輕輕顛倒30次以上進行混勻，進樣，測定血紅蛋白水平、MCV、MCH等參數(shù)。

5. DNA提取

按照試驗盒說明書中的操作方法提取血液中的DNA。檢測DNA的濃度，并且用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和片段大小。

6. 缺失型突變的跨越裂口 PCR（Gap-PCR）法檢測

PCR反應(yīng)體系包括7.5 μl 2×Power Taq PCR MasterMix、0.6 μl 10 μmol/L上游引物、0.3 μl 10 μmol/L野生型下游引物、0.3 μl 10 μmol/L突變體下游引物、50 ng DNA，最后以超純水補足至15 μl。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。用SEA-F、SEA-WR和SEA-MR引物檢測--SEA，用3.7-F、3.7-WR和3.7-MR引物檢測-α3.7，用4.2-F、4.2-WR和4.2-MR引物檢測-α4.2。

7. 目標(biāo)基因的PCR擴增

PCR反應(yīng)體系包括：10 μl 5×TransStart FastPfu Fly buffer，4 μl 2.5 mmol/L dNTPs、1 μl 10 μmol/L上游引物、1 μl 10 μmol/L下游引物、200 ng DNA、1 μl TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase，最后以超純水補足50 μl。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性10 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。用HBA1-F和HBA1-R引物擴增HBA1基因，用HBA2-F和HBA2-R引物擴增HBA2基因，用HBB-F和HBB-R引物擴增HBB基因。將所有的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

8.? PCR產(chǎn)物的測序

電泳檢測目標(biāo)基因的PCR產(chǎn)物后，將目標(biāo)PCR條帶切出，委托廣州艾基生物有限公司進行測序檢測。HBA1基因PCR產(chǎn)物的測序引物是HBA1-F和HBA1-R，HBA2基因PCR產(chǎn)物的測序引物是HBA2-F和HBA2-R，HBB基因PCR產(chǎn)物的測序引物是HBB-F、HBB-R和HBB-ceR。

9. 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬

應(yīng)用SWISS-MODEL網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）模擬蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

10.? 血紅蛋白毛細管電泳

將抗凝血液200×g離心5 min，去除上層血漿，取50 μl紅細胞加入試管中。把裝有紅細胞的試管按順序放在儀器配套的檢測架上，在檢測架最后的位置加入約 4 ml溶血試劑。把檢測架送入毛細管電泳儀進行血紅蛋白電泳檢測，約30 min

后檢測程序完畢，查看結(jié)果。

結(jié)果

一、15例地貧篩查陽性患者的血常規(guī)檢測結(jié)果

15例地貧篩查陽性患者血紅蛋白64～125 g/L，MCV 54.0～85.1 fl，MCH 14.9～25.5 pg，詳見表2。

二、15例地貧患者血紅蛋白基因的突變類型分析

15例地貧患者中，檢測到--SEA缺失7例、-α3.7缺失4例、-α4.2缺失1例;共檢測到23種點突變類型，包括10種新位點突變，分別是HBA1： codon 14 TGG > TGA、HBA1： IVS-Ⅰ-65A > G、HBA1： codon 139 AAA > ATA、HBA2： -43 G> C、HBA2： c.*136 A > G、HBB： -99 G > A、HBB： -96 G > A、HBB： -62 G > A、HBB： c.56 C > T和HBB： 3UTR +133 G > C。我國南方非缺失型α 地貧主要是 Hb Constant Spring （ Hb CS） 和 Hb Quong Sze （ Hb QS） [3]。然而，從15例地貧患者中檢測到4例（27%）HBA1： codon 14 TGG>TGA突變（4例HBA1： codon 14TGG>TGA雜合突變體），僅檢測到3例Hb Constant Spring突變和1例Hb Quong Sze突變，因此HBA1： codon 14 TGG>TGA在福建省龍巖市很可能是一種常見的α地貧突變。檢測出的已知引起β地貧的位點突變有4種，分別是codon 17 （A->T）、codons 41/42 （-TTCT）、codon 43 （G->T） 和IVS-Ⅱ-654 （C->T）[4]。排除缺失，所有的α2珠蛋白基因均具有HBA2： -43 G>C、alpha2 +832 G->A和HBA2： c.*136A>G突變。

三、α1珠蛋白基因的3種新位點突變分析

HBA1： codon 14 TGG>TGA是α1珠蛋白基因第14密碼子突變成終止密碼子。已報道的α1珠蛋白基因第14密碼子變成終止密碼子的突變Codon 14 G>A是TGG突變成TAG，與HBA1： codon 14 TGG>TGA不同[4]。HBA1： IVS-Ⅰ-65A>G是α1珠蛋白基因第1個內(nèi)含子中第65堿基由A突變成G。HBA1： IVS-Ⅰ-65A>G的攜帶者同時具有造成β地貧的IVS-Ⅱ-654 （C->T）雜合突變，因此尚未確定HBA1：IVS-Ⅰ-65A>G是否造成α地貧[5]。HBA1： codon 139 AAA>ATA是α1珠蛋白基因第139密碼子由AAA突變成ATA，導(dǎo)致α珠蛋白第139氨基酸由賴氨酸突變成異亮氨酸。α珠蛋白由141個氨基酸構(gòu)成，該突變位于α珠蛋白的羧基端，不影響α珠蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

四、α2珠蛋白基因的2種新位點突變分析

HBA2： -43 G>C突變位于α2珠蛋白基因的5UTR中，起始密碼子前第43位堿基;HBA2： c.*136 A>G突變位于α2珠蛋白基因的3UTR中，終止密碼子后第136位堿基。第4例標(biāo)本具有--SEA雜合缺失、HBA2： -43G>C雜合突變、alpha2 +832 G->A雜合突變和HBA2： c.*136 A>G雜合突變，不具有-α3.7和-α4.2缺失，該標(biāo)本的血紅蛋白含量為125 g/L。有研究表明標(biāo)準(zhǔn)型α地貧（兩個α珠蛋白基因缺失或者突變）患者的血紅蛋白平均含量為114.0 g/L，HbH病（3個α珠蛋白基因缺失）患者的血紅蛋白平均含量為83.3 g/L[6]。因此，HBA2： -43 G>C突變和HBA2： c.*136A>G突變均不造成α地貧。

五、β珠蛋白基因的5種新位點突變分析

第10例標(biāo)本的β珠蛋白基因啟動子中第-99堿基（轉(zhuǎn)錄起始位點上游第99位堿基）和第-96堿基（轉(zhuǎn)錄起始位點上游第96位堿基）均具有G>A雜合突變，沒有其他點突變;血紅蛋白毛細管電泳檢測表明第10例標(biāo)本的HbA、HbF和HbA2的占比正常（表3），因此β珠蛋白基因的這種雙重雜合突變不造成β地貧，故將β珠蛋白基因的啟動子中第-99堿基的G>A突變命名為“HBB： -99 G>A”，第-96堿基的G>A突變命名為 “HBB： -96 G>A”。6例標(biāo)本的β珠蛋白基因的啟動子中第-62堿基（轉(zhuǎn)錄起始位點上游第62位堿基）具有G>A雜合突變。其中第1例標(biāo)本的β珠蛋白基因具有第-62堿基G>A雜合突變、HBB： c.9T>C雜合突變和IVS-Ⅱ-16 G>C雜合突變，血紅蛋白毛細管電泳檢測表明第1例標(biāo)本的HbA和HbF的占比正常，HbA2的占比偏低（表3），因此該例標(biāo)本具有輕度α地貧，β珠蛋白基因啟動子中第-62堿基G>A雜合突變不造成β地貧，故將β珠蛋白基因啟動子中第-62堿基G>A突變命名為“HBB： -62 G>A”。HBB： c.56 C>T是β珠蛋白基因第56密碼子的GGC（甘氨酸）>GGT（甘氨酸）同義突變，不影響基因功能。HBB： 3UTR+133 G>C位于β珠蛋白基因的終止子中，3UTR下游第133位堿基。共檢測到3例HBB： 3UTR+133 G>C雜合標(biāo)本，均具有IVS-Ⅱ-654 （C->T）雜合突變，其他標(biāo)本沒有檢測到IVS-Ⅱ-654 （C->T）突變。血紅蛋白毛細管電泳檢測表明3UTR+133 G>C和 IVS-Ⅱ-654 （C->T）雙重雜合的第9例標(biāo)本的HbA占比偏低，HbF和HbA2占比偏高（表3），該例標(biāo)本具有β地貧。有研究表明IVS-Ⅱ-654 （C->T）雜合突變體的HbA2占比為4.12% ～ 8.23%，HbF占比為0.30% ～ 5.54%，但是未清楚這些IVS-Ⅱ-654 （C->T）雜合突變體的β珠蛋白基因是否具有其他突變[7]。因此尚不能判斷 3UTR +133 G>C雜合突變是否造成β地貧。

討論

地貧是世界上最常見的遺傳性血液疾病，也是我國南方地區(qū)最常見的遺傳病，由珠蛋白基因的缺失或者點突變造成。本研究利用基因測序法發(fā)現(xiàn)了珠蛋白基因網(wǎng)站（http：//globin.cse.psu.edu/）沒有記錄的10種珠蛋白基因點突變——HBA1： codon 14 TGG>TGA、HBA1： IVS-I-65A>G、HBA1： codon 139 AAA>ATA、HBA2： -43 G>C、HBA2：c.*136A>G、HBB： -99 G>A、HBB： -96 G>A、HBB： -62 G>A、HBB： c.56 C>T和HBB： 3UTR +133 G>C，在PubMed上進行文獻檢索也未發(fā)現(xiàn)這10種點突變，證實這10種點突變是首次報道。

HBA1： codon 14 TGG>TGA是不同于Codon 14 G>A的另一種α1珠蛋白基因第14密碼子無義突變，造成α1珠蛋白基因喪失功能。既往研究對重慶市兒童、廣西北部灣地區(qū)地貧患者、深圳市地貧患者的α1珠蛋白基因測序，均未發(fā)現(xiàn)HBA1： codon 14 TGG>TGA突變[8-10]。因此，HBA1： codon 14 TGG>TGA很可能是福建省龍巖市人群特有的。從15例福建省龍巖市地貧患者中檢測到4例HBA1： codon 14 TGG>TGA攜帶者，因此HBA1： codon 14 TGG>TGA可能在該地區(qū)是常見的α地貧點突變。目前國內(nèi)大部分地貧基因檢測實驗室所使用的α地貧檢測試劑盒的檢測范圍為--SEA、 -α3.7、-α4.2、Hb CS、Hb QS和Hb WS[10-11]。因此，有必要在福建省龍巖市地貧患者中進行大樣本檢測確定HBA1： codon 14 TGG>TGA的攜帶率，若HBA1： codon 14 TGG>TGA的攜帶率與Hb CS、Hb QS或者Hb WS相近或者比其更高，則對該地區(qū)的地貧患者進行基因型分析時必須增加HBA1： codon 14 TGG>TGA檢測，彌補目前商品化檢測試劑盒的局限性，避免漏診、誤診，為患者提供更可靠的臨床咨詢依據(jù)。

HBA1： IVS-Ⅰ-65A>G是否造成α地貧有待進一步研究。雖然HBA1： codon 139 AAA>ATA不影響α珠蛋白的空間結(jié)構(gòu)，但是其對α珠蛋白功能的影響需要進一步研究。血紅蛋白含量檢測結(jié)果表明，HBA2： -43G>C突變和HBA2： c.*136A>G突變均不造成α地貧。血紅蛋白毛細管電泳檢測結(jié)果表明HBB： -99（G->A）和 HBB： -96（G->A）雙重雜合突變不造成β地貧，HBB： -62（G->A）的雜合突變也不造成β地貧。HBB： c.56 C>T是β珠蛋白基因第56密碼子的同義突變，不影響β珠蛋白基因的功能。HBB： 3UTR +133 G>C是終止子中的突變，尚不能判斷3UTR +133 G>C雜合突變是否造成β地貧。檢測到的4種已知引起β地貧的突變——codon 17 （A->T）、codons 41/42 （-TTCT）、codon 43 （G->T） 和IVS-Ⅱ-654 （C->T）均在商業(yè)化β地貧基因檢測試劑盒的檢測范圍內(nèi)[12]。從15例福建省龍巖市地貧患者中就檢測到5種α珠蛋白基因新位點突變和5種β珠蛋白基因新位點突變，表明該地區(qū)的α珠蛋白基因和β珠蛋白基因具有明顯的異質(zhì)性。

綜上所述，本研究首次報道了10種珠蛋白基因點突變，豐富了世界珠蛋白基因突變數(shù)據(jù)庫，也發(fā)現(xiàn)了15例福建省龍巖市地貧患者中就有4例是HBA1： codon 14 TGG>TGA攜帶者，值得日后進一步研究探討。

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（收稿日期：2018-11-28）

（本文編輯：林燕薇）