劉娟 梁蓉蓉 張穎麗 謝艾岑 黃花榮

【摘要】目的研究CC趨化因子受體5 （CCR5）第2胞外環(huán)特異性拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織自噬相關(guān)基因Beclinl、ATG5、LC3的表達和自噬泡形成的影響。方法將40只BALB/c小鼠隨機分為5組，每組各8只，空白對照組小鼠予生理鹽水腹腔注射致敏、生理鹽水滴鼻激發(fā)，致敏組小鼠予雞卵白蛋白（OVA）致敏、生理鹽水激發(fā)，哮喘模型組小鼠予OVA致敏、OVA激發(fā)，地塞米松磷酸鈉（Dex）組小鼠予OVA致敏、激發(fā)后予Dex尾靜脈注射，拮抗短肽組予OVA致敏、激發(fā)后予拮抗短肽尾靜脈注射。分別采用實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法和透射電鏡評估哮喘小鼠肺組織中自噬水平的變化。結(jié)果哮喘模型組的Beclinl、ATG5和LC3 mRNA表達水平及LC3蛋白表達水平均低于空白對照組（P均<0.05），拮抗短肽組的Beclinl、ATG5、LC3mRNA和蛋白表達水平均高于哮喘模型組（P均<0.05）。透射電鏡顯示，哮喘模型組小鼠肺組織中自噬泡數(shù)量較空白對照組稍減少，自噬泡主要位于具有免疫功能的2型肺泡上皮細(xì)胞。拮抗短肽組、Dex組中自噬泡數(shù)量較模型組增多，但多為未成熟的自噬泡，且自噬泡同樣主要位于2型肺泡上皮細(xì)胞中。結(jié)論哮喘小鼠存在自噬功能障礙，CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽能升高哮喘小鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白Beclinl、ATG5和LC3的表達水平。

【關(guān)鍵詞】哮喘;自噬;CC趨化因子受體5;拮抗短肽

哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性和支氣管周圍多種炎癥細(xì)胞浸潤為主要特征的慢性炎癥性疾病[1]。近年研究顯示，自噬作為一種廣泛存在于真核細(xì)胞中高度保守的分解代謝途徑，其功能受損可能與支氣管哮喘的發(fā)展進程相關(guān)[2]。趨化因子及其受體是研究哮喘發(fā)病機制和治療的重要靶點，在募集與激活炎癥細(xì)胞上發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3]。CC趨化因子受體5（CCR5）為一種跨膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，課題組先前的研究表明CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽對核因子-κB（NF-κB）有明顯的調(diào)控作用[4]。NF-κB對多種基因的表達有直接的調(diào)控作用。有關(guān)哮喘小鼠肺組織中CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽對細(xì)胞自噬基因的影響，筆者尚未見相關(guān)報道。為此，本研究擬探討CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織自噬相關(guān)基因Beclin1、ATG5、LC3表達和自噬泡形成的影響，為哮喘的精準(zhǔn)治療提供新的方向，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、材料與儀器

1.實驗動物

BALB/c小鼠40只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量20～229、由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于中山大學(xué)東校園實驗動物中心的SPF級環(huán)境中，本研究方案經(jīng)中山大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（IACUC-DD-17-1207）。

2.主要試劑與儀器

CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽序列由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科鐘英強教授惠贈，經(jīng)上海吉爾生化公司純化合成。地塞米松磷酸鈉購自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院。用生理鹽水分別將拮抗短肽和地塞米松磷酸鈉（Dex）注射液稀釋成濃度為2.5、3.0mg/kg備用[4]。雞卵白蛋白（OVA、V級）購自美國Sigmao Trizol試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成。Beclin 1抗體購自美國Santa Cruzeo ATG5和LC3抗體購自美國Sigmao電鏡固定液購自谷歌生物公司。主要儀器包括熒光定量PCR儀（Light Cycler 480，瑞士）和透射電鏡（Tecnai Spirit Biotwin，F(xiàn)EI公司）。

二、方法

1.分組及干預(yù)

哮喘小鼠模型的構(gòu)建參照本課題組前期的建立方法[4]。將40只小鼠隨機分為5組，每組各8只?？瞻讓φ战M小鼠予0.1ml的生理鹽水腹腔注射致敏、50μl的生理鹽水滴鼻激發(fā)，致敏組小鼠予0.1ml（含50μg的OVA）相同部位致敏、50μl的生理鹽水滴鼻激發(fā)，哮喘模型組小鼠予0.1ml含50μg的OVA）相同部位致敏、50μl（含 100μg的OVA）滴鼻激發(fā)，Dex組小鼠予模型組等體積、等濃度、同部位的OVA致敏、激發(fā)后連續(xù)7d予Dex 0.2ml尾靜脈注射，拮抗短肽組予模型組等體積、等濃度、同部位的OVA致敏、激發(fā)后連續(xù)7d予拮抗短肽注射液0.2ml尾靜脈注射給藥。

2.標(biāo)本采集

于實驗第22日將各組小鼠行斷頸處死，予生理鹽水經(jīng)右心室灌注后，待雙肺發(fā)白后分離肺組織，右肺用于蘇木素一伊紅（HE）染色，左肺收集后置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.哮喘小鼠肺組織中自噬泡的透射電鏡觀察

處死小鼠后，即取約米粒大小的肺組織投入電鏡固定液中，置于4℃C冰箱2h。用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗4次，每次15min、后再用1%餓酸4℃固定2h。經(jīng)過PBS漂洗和乙醇、丙酮脫水后，進行過夜包埋，制成厚度約50～80nm的切片，用醋酸雙氧鈾、拘櫞酸鉛雙染后置于透射電鏡下觀察。

4.Beclinl、ATG5、LC3 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR檢測。先利用Trizol法提取肺組織中的總RNA，根據(jù)Takara的逆轉(zhuǎn)錄法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA，并進一步參照其反應(yīng)條件，采用二步法擴增：95℃30s預(yù)變性，95℃ 5s持續(xù)40個循環(huán)，60℃32s退火和延伸。以價actin為內(nèi)參。引物序列分別為：Beclinl上游5'-GGGTCACCATCCAGGAAC-3、下游5'-CACCATCCTGGCGAG-3'，ATG5上游5=GCGGTTGAGGCTCAC-3、下游5，- GGATATTCCATGAGT-3，LO上游5，- GC GCTTGCAGCT-3、下游5'=GTACACTTCGGAGA-3，β-actin上游5'=CCACCATGTACCCAGGCATT-3、下游5'-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3。結(jié)果分析采用△△CT法計算各基因的相對表達水平。

5.Beclin1、ATG5、LC3蛋白表達水平的檢測 采用蛋白免疫印跡法檢測。先用PIRA裂解液和蛋白酶抑制劑提取肺組織中的總蛋白，用BCA法測相應(yīng)的蛋白濃度，95℃加熱10min使蛋白變性。利用12%分離膠進行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺（SDS-PAGE）電泳，然后恒定110V轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉室溫下封閉1.5h后，分別敷上一抗Beclinl、ATG5、LC3、GAPDH（抗體稀釋比例均為1：1000），4℃過夜。將條帶用TBST緩沖液洗4次，每次7min，室溫下孵育相應(yīng)的二抗（1：5000）持續(xù)1h、繼續(xù)用TBST緩沖液洗脫4次，每次7min、用高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影、定影，用Image J行灰度值分析、Prism 6.0行圖像分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、成功構(gòu)建由OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型

相對于空白對照組和致敏組而言，哮喘模型組中的支氣管及伴行的血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，且支氣管的管壁增厚、上皮細(xì)胞損傷，表明該小鼠哮喘模型建立成功，見圖1。

二、5組小鼠的肺組織自噬相關(guān)基因相對表達水平比較

5組小鼠的肺組織Bechnl、ATG5和LC3 mRNA相對表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為38.347、19.315、15.143，P均< 0.001）o其中哮喘模型組的Beclinl、ATG5和LC3 mRNA相對表達水平低于空白對照組（P均<0.05），分別約為空白對照組的19%、17%、28%0在利用拮抗短肽和Dex注射液干預(yù)之后，Beclinl、ATGS和LC3的mRNA相對表達水平較模型組均有所升高，其中拮抗短肽組的Beclinl、ATG5和LO mRNA相對表達水平分別約為哮喘模型組的2.53、3.41、1.96倍，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），但Dex組的Beclinl、ATG5和LC3 mRNA相對表達水平與哮喘模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），見圖2。

三、5組小鼠的肺組織自噬相關(guān)蛋白表達水平比較

5組小鼠的肺組織Beclinl、ATG5和LO蛋白表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為6.260、8.800、11.921，P均<0.001）。哮喘模型組LO的蛋白表達水平低于空白對照組（P<0.05），其Beclinl、ATG5的蛋白表達水平分別約為空白對照組的67%、80%;LO作為自噬形成的標(biāo)志性蛋白，哮喘模型組蛋白表達水平約為空白對照組的60%。相對于哮喘模型組，自噬相關(guān)蛋白Beclinl 、ATG5和LC3的蛋白表達水平在拮抗短肽組均升高，分別為哮喘模型組的1.53、1.42、1.71倍，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），見圖3。

四、5組小鼠的肺組織自噬泡比較

透射電鏡顯示，哮喘小鼠肺組織中自噬泡數(shù)量較空白對照組稍減少，自噬泡主要位于具有免疫功能的2型肺泡上皮細(xì)胞。拮抗短肽組、Dex組中自噬泡數(shù)量較模型組增多，但多為未成熟的自噬泡，且自噬泡同樣主要位于2型肺泡上皮細(xì)胞中，見圖4。

討論

哮喘是一種復(fù)雜的、多基因作用的氣道慢性炎癥性疾病，目前的治療仍以糖皮質(zhì)激素和β2受體激動劑為主，但隨著全球難治性哮喘的發(fā)生率逐年升高，尋求新的治療靶點成為研究的熱點之一。

近年國內(nèi)外的研究以自噬為突破點，尋求其在哮喘中的治療作用。Puleston等[5]認(rèn)為，自噬功能缺陷的T、B細(xì)胞表現(xiàn)出分化和調(diào)節(jié)受損。敲除小鼠胸腺中的ATG5基因不僅會減少T細(xì)胞在外周血中的數(shù)量，還會減弱其受到抗原刺激后的增殖作用，出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫耐受障礙[6]。此外，抑制自噬功能將引起活性氧簇的聚集和損傷性線粒體DNA的釋放增多[7]。Gu等[8]利用辛伐他汀作用于哮喘小鼠，結(jié)果顯示哮喘小鼠肺組織中自噬水平低于健康小鼠。上述研究均提示自噬功能低下可能導(dǎo)致支氣管哮喘等疾病的發(fā)生。本研究也顯示，哮喘模型組小鼠的肺組織中自噬相關(guān)基因Beclinl、ATG5和LC3 mRNA與蛋白表達水平和自噬泡的數(shù)量均低于空白對照組，且自噬泡主要位于同樣具有免疫功能的2型肺泡上皮細(xì)胞中，進一步闡明在哮喘小鼠的肺組織中，自噬功能存在障礙。

CCR5作為一種調(diào)控T細(xì)胞和炎癥細(xì)胞遷移、增殖和活化的趨化因子受體，不僅在炎癥性腸病、銀屑病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等發(fā)揮作用，還可能促進哮喘的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。本課題組前期已經(jīng)證實，利用CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽干預(yù)哮喘模型小鼠，能有效減輕小鼠肺組織的氣道炎癥反應(yīng)[4]。Venuti等叫利用CCR5的抗體與其胞外環(huán)1結(jié)合，結(jié)果顯示其可以引起T細(xì)胞表面CCR5的陰性表達，可能是因為激活了細(xì)胞內(nèi)的信號通路，形成以CCR5為中心的復(fù)合體。上述研究說明，CCR5一方面能直接參與炎癥細(xì)胞的調(diào)控，另一方面可能通過激活下游信號分子或蛋白間接對炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié)。自噬作為一種在應(yīng)激狀態(tài)下能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分解代謝的途徑，運用CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽能否對其功能造成影響，并調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達，筆者尚未見相關(guān)報道。本研究利用Dex干預(yù)，并在減輕支氣管周圍炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上，采用CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽作用于哮喘小鼠，首次探討該拮抗短肽對自噬相關(guān)基因Beclinl、ATG5、LC3表達和自噬泡形成的影響，結(jié)果顯示，拮抗短肽組的自噬相關(guān)基因Beclinl、ATG5和LC3的mRNA表達水平均高于哮喘模型組，透射電鏡觀察同樣顯示該2組肺組織中的自噬泡數(shù)量多于哮喘模型組，提示該拮抗短肽能調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達。

宋楊達等[12]對炎癥性腸病的研究顯示，CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽可抑制TNF/NF-κB信號通路，減輕大鼠結(jié)腸炎的組織損傷。本課題組前期研究也顯示，哮喘小鼠中的拮抗短肽能同樣抑制TNF-α的表達。國外對Beclin 1的研究表明，Beclinl可能通過激活NF-κB通路對炎癥因子進行調(diào)控[13]。另有研究顯示，TNF-α作為上游因子，在激活下游的NF-κB通路時，可能通過抑制TSC1-TSC2的活性激活mTOR通路，實現(xiàn)對細(xì)胞的自噬功能進行調(diào)節(jié)[14]。上述研究提示，CCR5第2膜外環(huán)的特異性拮抗短肽可能是通過TNF/NF-κB信號通路對支氣管哮喘中細(xì)胞自噬功能進行調(diào)控的。

綜上所述，本研究首次探討CCR5第2胞外環(huán)的特異性拮抗短肽對哮喘小鼠自噬相關(guān)基因表達與自噬泡形成的影響，證實在哮喘小鼠中存在自噬功能障礙，而拮抗短肽能提高其自噬水平，且這一機制可能與TNF/NF-κB信號通路有關(guān)，這為哮喘的精準(zhǔn)治療研究提供了新方向。

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（收稿日期：2018-12-26）

（本文編輯：林燕薇）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.008

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313027，2016A03031343）;廣州市科技計劃項目（20180301004）

作者單位 510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科廣東省惡性腫瘤表觀遺傳和基因調(diào)控重點實驗室

通信作者，黃花榮，E-mail：hhrvivi@126.com