譚安薔，李芳嬋，吳玉強，羅宇東

（1.廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

壯藥藤苦參（Streptocaulon grif fithii Hook.f.）為蘿摩科（Asclepiadaceace）植物馬蓮鞍的干燥根，別名為古羊藤、老鴉咀、毛青才、南苦參、奶藤、馬達、紅馬連鞍、虎陰藤、老鴉嘴，具有清熱解毒、散瘀止痛、抗腫瘤的功效，對感冒發(fā)熱、跌打損傷等有一定的療效［1-2］。藤苦參屬大宗壯瑤藥材，為外感風痧顆粒（片）的主要藥材之一。目前對藤苦參的研究多集中在化學成分上，其主要成分為皂苷類和強心苷類，而對其提取工藝研究甚少［2-8］。本文以總皂苷提取量和得膏率為評價指標，采用正交試驗法對藤苦參的提取工藝進行優(yōu)選。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑 藤苦參購自南寧市景昌中藥飲片有限公司（批號:20160401），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為藤苦參，符合《廣西壯族自治區(qū)壯藥材質(zhì)量標準匯編》（第1卷）中藤苦參的藥材標準［9］；人參皂苷Re對照品由中國食品藥品檢定研究院提供（批號:110704-201424）；其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 752型紫外-可見分光光度計（上海舜宇恒平儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測定方法考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re標準品適量，置于10 ml的容量瓶，加80%甲醇配制成0.60 mg/ml的人參皂苷Re對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取過4號篩的藤苦參粗粉5 g，加10倍量的95%乙醇，于85℃水浴中回流提取2次，每次80 min，合并提取液，于85℃水浴濃縮至無醇味，烘干，即得藤苦參提取物粗品，干膏得率為11.2%。取上述提取物粗品112 mg（相當于生藥材1 g），置于10 ml量瓶中加80%甲醇溶解并定容，取上述溶液1 ml置于10 ml容量瓶中，加80%甲醇定容至刻度線，即得。

2.1.3 標準曲線制備 取人參皂苷Re對照品溶液60 μl、90 μl、120 μl、150 μl、180 μl、210 μl，置于干燥具塞試管中，揮干，分別加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60℃水浴中15 min，取出，流水冷卻1 min，分別加入冰醋酸5 ml，搖勻，以隨行試劑作空白，于550 nm處測定吸光度（A），以吸光度A為縱坐標，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1。結(jié)果線性方程為A=15.552C+0.0009（r2=0.9999），線性范圍 6～21 μg/ml。

圖1 人參皂苷Re對照品標準曲線

2.1.4 精密度考察 取對照品溶液20 μl置于干燥具塞試管中，揮干，按“2.1.3項”方法測定吸光度（A），連續(xù)測定6次，以吸光度（A）計算，求得RSD=1.3%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性考察 取同一批樣品（6份）的供試品溶液20 μl，按“2.1.3項”方法測定吸光度，計算RSD為1.5%，顯示該方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取供試品溶液20 μl，按“2.1.3項”下方法處理，在0 min，15 min，30 min，60 min，90 min，120 min時測定吸光度，計算得RSD為1.7%，說明供試品溶液顯色后在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率考察 取已知總皂苷含量的藤苦參提取物適量（6份），精密稱定，置于10 ml容量瓶中，加入人參皂苷 Re對照品溶液（0.60 mg/ml）8.7 ml，加80%甲醇定容至刻度線，按“2.1.2項”方法制備供試品溶液，按“2.1.3項”方法測吸光度，計算得平均回收率為99.92%，RSD=1.56%，結(jié)果見表1。顯示本法測定的結(jié)果準確可信。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.1.8 樣品含量測定 精密取6批干膏樣品適量，按“2.1.2項”方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液20 μl置于干燥具塞試管中，按“2.1.3項”方法測定吸光度，計算總皂苷含量，結(jié)果RSD為0.38%。見表2。

表2 6批樣品含量測定結(jié)果 （n=6）

2.2 提取工藝優(yōu)化 參考文獻［10-13］選擇溶劑量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素（表3），以干膏得率和總皂苷提取量為指標進行評價。取過4號篩的藤苦參粉末5 g（共9份），按L9（34）正交表（表4）完成9組試驗，按“2.1.2項”方法制備供試品溶液，按“2.1.3項”方法測定吸光度，計算總皂苷提取量。取9組提取液適量，置于已經(jīng)在105℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按《中華人民共和國藥典》2015版（四部）總浸出物的測定方法測定得膏率。得膏率=干膏質(zhì)量/水提液質(zhì)量×100%。正交試驗結(jié)果見表4，方差分析見表5、表6。

表3 試驗因素與水平列表

表4 正交試驗方案設(shè)計和結(jié)果

表5 得膏率方差分析

表6 總皂苷提取量方差分析

表4結(jié)果顯示，以干膏得率為指標，3個因素的R大小順序為:C＞B＞A，最佳工藝組合為 A3B3C2；以總皂苷提取量為指標，3個因素的R值大小順序為:B＞C＞A，最佳工藝組合為A2B3C2。以空白為誤差列分別對得膏率、總皂苷提取量進行方差分析，發(fā)現(xiàn)乙醇用量（B）、提取次數(shù)（C）對得膏率、總皂苷提取量影響顯著（P＜0.05），提取時間（A）對得膏率無顯著性影響。綜合考慮得膏率、總皂苷的提取結(jié)果，確定藤苦參最佳提取工藝參數(shù)為A2B3C2:提取時間60 min，溶劑量10倍，提取次數(shù)2次。

2.3 驗證試驗 取過4號篩的藤苦參粉末5 g，共3份，按上述優(yōu)選的工藝參數(shù)A2B3C2進行驗證試驗，測定得膏率和皂苷含量，結(jié)果藤苦參中總皂苷含量為95.00 mg/g，得膏率為9.5%，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行、重復性好，見表7。

表7 驗證試驗結(jié)果

3 討 論

皂苷在自然界中分布廣泛，資源豐富，結(jié)構(gòu)多樣，具有抗炎、抗腫瘤、提高動物免疫力、抗氧化等作用，藥用價值高，具有一定的開發(fā)潛力［10］。藤苦參屬廣西特色壯瑤藥材，也是廣西中醫(yī)藥大學制藥廠產(chǎn)品外感風痧顆粒的主藥之一，但目前對于其提取工藝研究不足。根據(jù)文獻報道，藤苦參主要含有皂苷和強心苷類等生物活性的重要成分［10-12］。通過文獻研究［13-14］選擇乙醇為藤苦參總皂苷的提取溶劑，預試驗發(fā)現(xiàn)95%乙醇提取率最高，因此本文選擇95%為提取溶劑，考察乙醇用量、時間、次數(shù)對藤苦參總皂苷提取的影響，最終優(yōu)選出藤苦參總皂苷提取工藝為提取時間60 min，溶劑量10倍，提取次數(shù)2次。所優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、合理，有效成分提取率高，可為今后藤苦參的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。