劉仲陽(yáng)，袁欣

（保定市第二中心醫(yī)院 胸外科，河北 保定 072750）

食管癌（esophageal carcinoma,EC）是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全球EC 的新發(fā)病例約45.6 萬(wàn)，死亡病例約40.0 萬(wàn)[1]。我國(guó)EC的發(fā)病率居世界首位，每年約有25.9 萬(wàn)新發(fā)病例，21.1 萬(wàn)死亡病例[2]。近年來(lái)，EC 的診斷和治療取得了較大進(jìn)展，然而EC 患者的預(yù)后仍不樂(lè)觀，其5年生存率僅25%左右[3]。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致EC 患者不良預(yù)后的主要原因[4]，而新生血管形成在EC 侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。血管生成素樣蛋白（angiopoietinlike protein,ANGPTL）是一類(lèi)分泌型糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于血管生成素，而功能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相似，ANGPTL 3 可誘導(dǎo)新生血管形成[5]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲。目前關(guān)于ANGPTL 3 的研究尚處于初始階段，且ANGPTL 3 在EC 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用所知甚少。內(nèi)皮素（Endothelin,ET）系統(tǒng)高度活化與腫瘤新生血管形成密切相關(guān)[6]，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶（endothelinconverting enzyme,ECE）可裂解前體ET，進(jìn)而激活ET 系統(tǒng)。有研究證實(shí)，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶-1（endothelinconverting enzyme-1,ECE-1）可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲[7]。本研究旨在檢測(cè)ANGPTL 3、ECE-1 在EC組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)對(duì)EC 患者病情預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年1月—2013年1月保定市第二中心醫(yī)院行切除手術(shù)的EC 患者的癌組織及其癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具備完整的病歷資料；②術(shù)前未接受放化療；③術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為EC；④均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?lài)?yán)重肝腎功能不全；②合并全身性感染；③合并其他惡性腫瘤等。共選取95 例EC 患者。其中，男性49 例，女性46 例；年齡＜60 歲患者65 例，≥60 歲患者30 例；中高分化程度 72 例，低分化程度23 例；腫瘤直徑＜5 cm 58 例，腫瘤直徑≥5 cm 37 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43 例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移34 例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移61 例；TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期75 例，Ⅲ、Ⅳ期20 例。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ANGPTL 3、ECE-1 的表達(dá)

取EC 組織和癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本，常規(guī)二甲苯脫蠟、浸泡水化（依次為100%、95%、80%和70%酒精）后，蒸餾水清洗3 次，每次3 min；滴加3% H2O2，孵育10 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，每次3 min；枸櫞酸鈉溶液（10 mmol/L，pH 6.0），加熱至100℃，持續(xù)10 min，逐漸冷卻至室溫，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加羊血清工作液，37℃封閉10 min，棄去血清；分別滴加ANGPTL 3、ECE-1 一抗工作液，4℃孵育過(guò)夜，PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加新鮮配制的DAB 溶液，進(jìn)行顯色反應(yīng)，蒸餾水清洗3 次，每次3 min；蘇木精-伊紅染色法復(fù)染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：ANGPTL 3、ECE-1 主要定位于細(xì)胞質(zhì)。光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取10 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：＜5%為0 分；6%～25%為1 分；26 %～50% 為2 分；51%～75% 為3 分；＞75%為4 分。著色強(qiáng)度：黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分與著色強(qiáng)度評(píng)分的乘積進(jìn)行結(jié)果判定，5～12 分為陽(yáng)性表達(dá)，0～4 分為陰性表達(dá)。

1.3 術(shù)后隨訪

以患者術(shù)后為起點(diǎn)，通過(guò)電話、門(mén)診等方式對(duì)患者及其家屬進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為手術(shù)后1～60 個(gè)月，直至患者死亡或者隨訪時(shí)間結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例或率（%）表示，兩樣本間陽(yáng)性率的比較分別采用χ2檢驗(yàn)，兩蛋白表達(dá)水平間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析，EC 患者預(yù)后的影響分析采用Kaplan Meier 法、Log-rank χ2檢驗(yàn)及Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，對(duì)各組生存率曲線分布進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 ANGPTL 3、ECE-1 在不同食管組織中的表達(dá)情況

EC組織中ANGPTL 3的陽(yáng)性表達(dá)率與癌旁正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=73.889，P=0.000），EC 組織[63.16%（60/95）]高于癌旁正常組織[4.21%（4/95）]；EC 組織中ECE-1 的陽(yáng)性表達(dá)率與癌旁正常組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=66.193，P=0.000）；EC 組織[53.68%（51/95）]高于癌旁正常組織[1.05%（1/95）]。見(jiàn)圖1、2。

2.2 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)與患者臨床病例特征的關(guān)系

EC 組織中，ANGPTL 3 表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM 分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤直徑相關(guān)（P＜0.05）。ANGPTL 3 在腫瘤直徑≥5cm 的EC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為78.38%（29/37），高于在腫瘤直徑＜5 cm 的EC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率[53.45%（31/58）]（P＜0.05）；ECE-1 表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。ECE-1 在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的EC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為76.47%（26/34），高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的EC 癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率[40.98%（25/61）]（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 EC 組織中ANGPTL 3 與ECE-1 表達(dá)的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，在EC 組織中，ANGPTL 3與ECE-1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.610，P=0.000）（見(jiàn)表2）。相關(guān)散點(diǎn)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3。

2.4 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

根據(jù)EC 組織中ANGPTL 3表達(dá)情況，將EC患者分為ANGPTL 3陽(yáng)性表達(dá)組和ANGPTL 3 陰性表達(dá)組，ANGPTL 3 陽(yáng)性表達(dá)組術(shù)后5年總生存率與ANGPTL 3 陰性表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.760，P=0.000），ANGPTL 3 陽(yáng)性表達(dá)組[25.00%（15/60）]低于ANGPTL 3陰性表達(dá)組[82.86%（29/35）]。Log-rank χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ANGPTL 3 陽(yáng)性表達(dá)組的平均生存時(shí)間與ANGPTL 3陰性表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.979，P=0.000），ANGPTL 3 陽(yáng)性表達(dá)組[（40.35±2.43）個(gè)月]低于ANGPTL 3 陰性表達(dá)組[（56.17±1.59）個(gè)月]（見(jiàn)圖4A）。

圖1 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 的表達(dá)情況 （蘇木精-伊紅 ×200）

根據(jù)EC 癌組織中ECE-1 表達(dá)情況，將EC 患者分為ECE-1 陽(yáng)性表達(dá)組和ECE-1 陰性表達(dá)組，ECE-1 陽(yáng)性表達(dá)組的術(shù)后5年總生存率與ECE-1 陰性表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.464，P=0.006），ECE-1 陽(yáng)性表達(dá)組[33.33%（17/51）]低于 ECE-1 陰性表達(dá)組[61.36%（27/44）]。Log-rank χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ECE-1 陽(yáng)性表達(dá)組的平均生存時(shí)間與ECE-1 陰性表達(dá)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.788，P=0.002），ECE-1 陽(yáng)性表達(dá)組[（40.43±2.67）個(gè)月]低于ECE-1 陰性表達(dá)組[（52.84±2.00）個(gè)月]（見(jiàn)圖4B）。

表1 患者臨床病例特征與EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)的關(guān)系 例

表2 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)的相關(guān)性 例

圖3 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.5 EC 生存預(yù)后的影響因素分析

以本研究95 例患者資料為樣本，以EC 生存預(yù)后狀態(tài)為應(yīng)變量（賦值：1=死亡，0=生存，t=生存期），建立Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。自變量為EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)。此外，加上單因素分析中 α入=0.10 的指標(biāo)，如腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑及TNM 分期等指標(biāo)/因素，回歸過(guò)程采用后退法，自變量退出α出=0.05?；貧w結(jié)果：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及ANGPTL3、ECE-1 表達(dá)均被保留入回歸模型（P＜0.05），相對(duì)危險(xiǎn)度為1.6～2.3，提示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)陽(yáng)性是影響EC 生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

圖4 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

表3 EC 生存預(yù)后的影響因素Cox 分析結(jié)果

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的ANGPTL 家族蛋白共有8 種，分別命名為ANGPTL 1～8，且不同ANGPTL 蛋白在功能上表現(xiàn)出多樣性，如ANGPTL 1 在炎癥、脂肪代謝中發(fā)揮作用，而ANGPTL 3 參與調(diào)節(jié)胰島素抵抗、脂肪代謝等[8]。ANGPTL 3 基因定位于染色體1p31，編碼由460 個(gè)氨基酸組成的分子量約為70 kD 的分泌型蛋白，ANGPTL 3 在肝臟組織中特異性表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)量極少[9-10]。目前，關(guān)于ANGPTL 3與腫瘤的關(guān)系的研究較少，KOYAMA 等[11]在口腔癌中的研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL 3 呈高表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤大小呈正相關(guān)。而本研究中，與癌旁正常組織比較，ANGPTL 3 在EC 癌組織中的表達(dá)增加，且腫瘤直徑越大，ANGPTL 3 陽(yáng)性率越高，提示ANGPTL 3 可能參與了EC 腫瘤形成。同時(shí)ANGPTL 3 高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，新生血管形成是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)必備條件，推測(cè)ANGPTL 3 可能通過(guò)誘導(dǎo)新生血管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。CAMENISCH 等[5]證實(shí)ANGPTL 3 與整合素αvβ3 受體結(jié)合，可刺激血管生成，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移。近年來(lái)，關(guān)于ANGPTL 3 促進(jìn)新生血管形成的機(jī)制研究并未取得突破性進(jìn)展，本研究將在后續(xù)工作中對(duì)其內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行深入探究。

ET-1 是一種內(nèi)源性生物多肽，具有強(qiáng)大的收縮血管作用，在調(diào)節(jié)微循環(huán)灌流及血管張力方面發(fā)揮非常重要的作用，ECE-1 可裂解前體ET-1，生成成熟的ET-1，進(jìn)而參與機(jī)體的生理病理過(guò)程[12-13]。大量研究證實(shí)，ECE-1 在子宮內(nèi)膜癌[14]、前列腺癌[15]、肺癌等[16]多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，而關(guān)于ECE-1 在腫瘤細(xì)胞中所發(fā)揮的功能及其高表達(dá)的臨床意義的報(bào)道較少，如SMOLLICH 等[17]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，ECE-1 高表達(dá)與高復(fù)發(fā)率密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ECE-1在EC 組織中具有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，且ECE-1 高表達(dá)與腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示ECE-1 在EC 發(fā)生和惡性進(jìn)展（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）中發(fā)揮促進(jìn)作用。體外細(xì)胞水平的研究結(jié)果表明，ECE-1 能夠促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞增殖[18]、增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞[19]和卵巢癌細(xì)胞[20]的侵襲能力，以上研究結(jié)論與本研究的臨床病例研究結(jié)果，共同證實(shí)ECE-1 參與并促進(jìn)腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，本研究推測(cè)ECE-1 可能通過(guò)激活ET 系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)腫瘤新生血管形成過(guò)程，進(jìn)而為腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移提供條件，其內(nèi)在機(jī)制將在后續(xù)工作中進(jìn)行深入探索。

以上結(jié)果提示，ANGPTL 3 和ECE-1 可能在新生血管形成過(guò)程中均發(fā)揮促進(jìn)作用，本研究進(jìn)一步地分析ANGPTL 3 與ECE-1 表達(dá)之間的相關(guān)性，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在EC 癌組織中ANGPTL 3 與ECE-1 表達(dá)之間呈正 相 關(guān)，提示ANGPTL 3 與ECE-1 在EC 腫瘤形成、腫瘤生長(zhǎng)及惡性進(jìn)展過(guò)程中可能發(fā)揮協(xié)同作用，共同誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。而Kaplan Meier 法的分析結(jié)果顯示，ANGPTL 3 陽(yáng)性表達(dá)及ECE-1 陽(yáng)性表達(dá)，均可能預(yù)示著患者較低的術(shù)后總生存率和較短的平均生存時(shí)間，提示ANGPTL 3 和ECE-1 高表達(dá)與EC 患者不良預(yù)后密切相關(guān)。此外，Cox 回歸分析也證實(shí)：ANGPTL 3 陽(yáng)性表達(dá)及ECE-1陽(yáng)性表達(dá)，均是EC 患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素。當(dāng)然，由于本研究中的樣本數(shù)量有限，為得到更確切的結(jié)論，后期將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在EC 組織中，ANGPTL 3和ECE-1 均具有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，均與患者較差的病理特征、不良預(yù)后相關(guān)，且ANGPTL 3 與ECE-1表達(dá)之間呈正相關(guān)，提示ANGPTL 3 和ECE-1 可能在EC 發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用，且均具有作為EC 患者病情評(píng)估、預(yù)后判斷及治療靶點(diǎn)的潛能。