朱麗華，李佳，李兵

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院 山東省中西醫(yī)結(jié)合眼病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250002；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000）

全世界主要的致盲疾病中，白內(nèi)障占首要位置。晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體前囊膜下一層單層細(xì)胞，維持晶狀體的正常代謝，阻擋房水內(nèi)任何有害物質(zhì)進(jìn)入晶狀體，一旦晶狀體上皮細(xì)胞功能障礙，就會(huì)引起晶狀體代謝紊亂，出現(xiàn)混濁，最終導(dǎo)致白內(nèi)障。白內(nèi)障的誘發(fā)因素很多，氧化應(yīng)激是主要原因，其次是細(xì)胞凋亡，氧化損傷也是細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素之一[1]。過(guò)量的活性氧（ROS）可以直接攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致晶狀體受損，還可以作為信號(hào)通路的上游信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子并介導(dǎo)過(guò)氧化氫H2O2對(duì)晶狀體的損傷[2]。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是細(xì)胞抵御氧化損傷、抗凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 蛋白對(duì)各種以氧化應(yīng)激和凋亡為主要發(fā)病機(jī)制的疾病都具有保護(hù)作用[3-4]。本研究主要探討Nrf2 在晶狀體上皮細(xì)胞對(duì)抗H2O2氧化損傷和凋亡的作用，并為今后探討防治白內(nèi)障提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人晶狀體上皮細(xì)胞（SRA01/04）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BI 公司，活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，超氧化物酶歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Nrf2 一抗、剪切型Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）、Bax、Bcl-2 一抗購(gòu)自美國(guó)Absci 公司，GAPDH、辣根過(guò)氧化物酶二抗購(gòu)自杭州弗德生物公司，Dapi 染色液購(gòu)自北京索萊寶公司，熒光二抗購(gòu)自北京博奧森公司，核漿蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

恒溫水浴箱（上海森信RP-9160），轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Biorad 公司），垂直電泳槽（美國(guó)Biorad 公司），電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司），免疫熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、超凈臺(tái)及孵育箱（美國(guó)Biorad 公司），恒溫?fù)u床（美國(guó)Forma Scientific 公司），超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Bioteck/EPoch 公司），制冰機(jī)（意大利Scotsman AF100 公司）

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將SRA01/04 培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）的MEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶常規(guī)傳代。

1.3.2 MTT 檢測(cè)不同濃度H2O2處理的SRA01/04 活性將細(xì)胞按照不同處理方式分組。分為正常對(duì)照組（不加入H2O2）、H2O250 μmol/L 組（加入50 μmol/L H2O2）、H2O2100 μmol/L 組（加入100 μmol/L H2O2）、H2O2200 μmol/L 組（加 入200 μmol/L H2O2）、H2O2300 μmol/L 組（加入300 μmol/L H2O2）和H2O2400 μmol/L 組（加入400 μmol/L H2O2）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SRA01/04按2×103個(gè)/100μl 濃度接種在96 孔板，MEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁，后加入稀釋好的含不同濃度H2O2的MEM 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)24 和48 h 后酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（OD）值。

1.3.3 細(xì)胞分組將細(xì)胞按照不同處理方式分組：正常對(duì)照組（不加入H2O2），H2O2低濃度組（H2O2濃度為100μmol/L），H2O2中濃度組（H2O2濃度為200μmol/L），H2O2高濃度組（H2O2濃度為300μmol/L），Nrf2 抑制組（GSK-3β+H2O2300μmol/L）。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 含量5 組細(xì)胞處理48h 后，將細(xì)胞收集于稀釋好的DCFH-DA 中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min。用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.3.5 SOD 含量檢測(cè)將5 組細(xì)胞處理48h 后，收集細(xì)胞和上清液，每組分為空白管、對(duì)照空白管、測(cè)試管和對(duì)照測(cè)試管，混勻，37℃孵育20min，450nm處酶標(biāo)儀讀數(shù)，細(xì)胞中SOD 活力=SOD 抑制率/ 50%×12×樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.6 Western blotting 檢測(cè)Nrf2 總蛋白、核蛋白、漿蛋白，Cleaved-Caspase-3，Bax 和Bcl-2 相對(duì)表達(dá)將5 組細(xì)胞處理48h 后，每組的1/2 細(xì)胞用于提取細(xì)胞中的核蛋白、漿蛋白，其余1/2 細(xì)胞用于提取總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)定量。蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，用脫脂奶粉封閉1h，封閉好的PVDF 膜分別浸于不同的一抗孵育液里（兔抗Nrf2 以1 ∶500，兔抗Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2 以1 ∶500 稀釋，兔抗GAPDH 以1 ∶1000 稀釋）4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗。將PVDF 膜浸于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1 ∶1000）孵育液中1.5h，TBST 清洗。利用高敏感性化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法成像。

1.3.7 免疫熒光檢測(cè)Nrf2 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位將4 組細(xì)胞按3000 個(gè)/100μl 接種于有小圓玻片上的6 孔板上，在細(xì)胞培養(yǎng)箱貼壁24h，按照分組相應(yīng)處理48h 后，磷酸鹽緩沖液沖洗玻片，4%多聚甲醛固定5min，磷酸鹽緩沖液沖洗玻片，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）透明10min 增加細(xì)胞膜通透性，1%牛血清白蛋白封閉1h，兔抗Nrf2 一抗4℃封閉過(guò)夜，羊抗兔二抗1h，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole 4',DAPI）染核10min，磷酸鹽緩沖液沖洗，將小圓玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析和單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間的細(xì)胞活力比較

各個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力有差異（F=268.540，P=0.000），處理時(shí)間為48h 時(shí)，細(xì)胞活力最低。②組間細(xì)胞活力有差異（F=126.450，P=0.001），在48h 時(shí)，各濃度組的細(xì)胞活力的變化最有意義。③各濃度實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組的細(xì)胞活力變化趨勢(shì)有差異（F=254.110，P=0.002）。與正常對(duì)照組比較，H2O250μmol/L 組、H2O2100μmol/L 組、H2O2200μmol/L 組及H2O2300μmol/L組的細(xì)胞活力均下降（P＜0.05），當(dāng)濃度為400μmol/L 時(shí)，細(xì)胞不可逆死亡。見(jiàn)表1。

2.2 各組ROS 含量比較

處理48h 后，各組ROS 含量的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2851.340，P=0.000），與正常對(duì)照組比較，各處理組的ROS 含量升高（P＜0.05），Nrf2 抑制組與H2O2高濃度組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1 和表2。

2.3 各組SOD 含量比較

處理48h 后，各組SOD 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常對(duì)照組比較，各處理組的SOD 含量降低（P＜0.05），與H2O2高濃度組比較，Nrf2 抑制組SOD 含量減少（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組不同時(shí)間的細(xì)胞活力比較 （±s）

表1 各組不同時(shí)間的細(xì)胞活力比較 （±s）

組別 12 h 24 h 48 h正常對(duì)照組 0.762±0.113 0.756±0.021 0.751±0.020 H2O2 50 μmol/L 組 0.712±0.010 0.709±0.091 0.711±0.012 H2O2 100 μmol/L 組 0.586±0.041 0.487±0.030 0.411±0.012 H2O2 200 μmol/L 組 0.391±0.024 0.352±0.031 0.231±0.043 H2O2 300 μmol/L 組 0.305±0.102 0.272±0.087 0.178±0.010 H2O2 400 μmol/L 組 0.013±0.001 0.004±0.009 0.001±0.006

2.4 各組各蛋白表達(dá)的比較

處理48h 后，各組Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、Nrf2 總蛋白、Nrf2 核蛋白、Nrf2 漿蛋白表達(dá)的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，H2O2各個(gè)濃度組Bax 表達(dá)下降（P＜0.05）；與正常對(duì)照組比較，H2O2低濃度組Bcl-2 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H2O2各個(gè)濃度組Cleaved-Caspase-3 表達(dá)下降（P＜0.05）；各個(gè)濃度組Nrf2 總蛋白、核蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；Nrf2 漿蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。與H2O2高濃度組比較，Nrf2 抑制組Bax 表達(dá)升高（P＜0.05）、Bcl-2 表達(dá)降低（P＜0.05）、Cleaved-Caspase-3表達(dá)升高（P＜0.05），Nrf2 抑制組的Nrf2 總蛋白、核蛋白、漿蛋白基本不表達(dá)。見(jiàn)圖2 和表3。

圖1 各組ROS 含量比較

表2 各組細(xì)胞ROS 和SOD 含量 （±s）

表2 各組細(xì)胞ROS 和SOD 含量 （±s）

注：1）與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與H2O2 高濃度組比較，P＜0.05

組別 ROS SOD正常對(duì)照組 46.52±3.25 89.93±2.29 H2O2 低濃度組 55.48±2.961） 72.00±7.731）H2O2 中濃度組 69.58±4.431） 52.70±6.081）H2O2 高濃度組 83.18±3.931） 45.08±5.471）Nrf2 抑制組 75.98±6.561） 13.78±4.841）2）F 值 22 851.349 12 075.170 P 值 0.000 0.000

圖2 Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3 及Nrf2 總蛋白、核蛋白、漿蛋白的相對(duì)表達(dá)量

表3 各組細(xì)胞內(nèi)各蛋白的相對(duì)表達(dá)比較 （±s）

表3 各組細(xì)胞內(nèi)各蛋白的相對(duì)表達(dá)比較 （±s）

注：1）正常對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與H2O2 高濃度組比較，P＜0.05

組別 Bax Bcl-2 Cleaved-Caspase-3 Nrf2 總蛋白 Nrf2 核蛋白 Nrf2 漿蛋白正常對(duì)照組 0.23±0.02 0.19±0.31 1.41±0.05 0.51±0.02 0.25±0.03 1.18±0.21 H2O2 低濃度組 0.13±0.111） 0.26±0.33 1.02±0.111） 0.59±0.031） 0.29±0.041） 0.87±0.181）H2O2 中濃度組 0.08±0.021） 0.42±0.051） 0.75±0.051） 0.81±0.071） 0.53±0.121） 0.40±0.071）H2O2 高濃度組 0.03±0.121） 0.61±0.041） 0.55±0.071） 1.10±0.101） 0.74±0.081） 0.16±0.031）Nrf2 抑制組 0.43±0.031）2 0.22±0.021）2） 0.92±0.121）2） 0.12±0.051）2） 0.10±0.031）2） 0.05±0.031）2）F 值 565.320 2 871.210 300.650 23.110 6 964.410 462.170 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 Nrf2 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位

細(xì)胞經(jīng)H2O2各濃度組處理48h 后，與正常對(duì)照組比較，Nrf2 表達(dá)增多，且發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)移，H2O2高濃度組核內(nèi)轉(zhuǎn)移最為明顯。Nrf2 抑制組檢測(cè)不到Nrf2的表達(dá)。見(jiàn)圖3。

3 討論

Nrf2 廣泛存在于多個(gè)組織器官內(nèi)，在正常環(huán)境下的細(xì)胞中，Nrf2 處于靜止?fàn)顟B(tài)，并不表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2 與Keap1 解離并釋放[5-6]，Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，Nrf2-ARE 信號(hào)通路活化并發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，經(jīng)研究證實(shí)，Nrf2-ARE 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的內(nèi)源性保護(hù)基因有200 多個(gè)，在增強(qiáng)組織抗氧化能力、保護(hù)組織細(xì)胞免受毒物損害、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤等方面起著非常重要的作用[7-8]。該信號(hào)通路上調(diào)其基因產(chǎn)物的表達(dá)對(duì)帕金森病、腦出血、白癜風(fēng)、糖尿病腎病等均具有很強(qiáng)的組織細(xì)胞保護(hù)能力[9-11]。ROS能引起一系列的生化改變，包括脂質(zhì)、蛋白、核酸損傷。晶狀體上皮細(xì)胞細(xì)胞膜由脂質(zhì)組成。當(dāng)受到自由基的攻擊，產(chǎn)生過(guò)氧化物。氧化損傷也可以讓蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)向改變，導(dǎo)致晶狀體混濁，自由基也可以導(dǎo)致DNA損傷，引起細(xì)胞生物活性改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、突變，最終晶狀體變混濁。

圖3 Nrf-2 的表達(dá)和定位 （免疫熒光×200）

Bcl-2 家族與Caspase 家族，作為重要的抗凋亡蛋白，在線粒體通路中分別發(fā)揮著凋亡調(diào)節(jié)作用和凋亡執(zhí)行作用。Bax、Bak 等存在于胞質(zhì)中，是Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-2、Bcl-xL 等則是抑凋亡蛋白，位于線粒體膜上。Cleaved-Caspase-3 是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行蛋白，是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子，它的活化表明細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段，是Caspase 家族中最重要的促凋亡蛋白。

筆者還發(fā)現(xiàn)，促凋亡基因Cleaved-Caspase-3 和Bax 隨H2O2濃度升高而下降，而抑凋亡蛋白Bcl-2 隨H2O2濃度升高而升高，表明晶狀體上皮細(xì)胞自身有抗一定的凋亡能力，推測(cè)這可能與晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激后，Nrf2 表達(dá)增多有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 的負(fù)性調(diào)節(jié)除了Keap1 之外，Gsk-3β 可以介導(dǎo)核內(nèi)Nrf2 的出核降解，從而負(fù)性調(diào)節(jié)Nrf2 相關(guān)通路[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)Nrf2 活性受到抑制后，晶狀體上皮細(xì)胞受到上游相同的ROS 的刺激，產(chǎn)生的抗氧化酶SOD 下降，促凋亡基因Cleaved-Caspase-3 及Bax 升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2 降低，驗(yàn)證晶狀體上皮細(xì)胞自身的抗氧化應(yīng)激與抗凋亡能力與Nrf2 表達(dá)有關(guān)。

隨著H2O2濃度的升高，Nrf2 蛋白表達(dá)增多，并且在H2O2中濃度組出現(xiàn)核易位趨勢(shì)，在H2O2高濃度組出現(xiàn)明顯核易位，這表明Nrf 表達(dá)增多和核易位增強(qiáng)了晶狀體上皮細(xì)胞自身抗氧化損傷的能力。

本研究顯示，Nrf2 蛋白表達(dá)和核易位在晶狀體上皮細(xì)胞自身抗氧化損傷和凋亡中起重要作用，可為白內(nèi)障形成機(jī)制和藥物治療的研制提供一個(gè)新的思路。