金明霞,王 怡,嵇保中,*,劉曙雯,徐立軍,張 磊,熊佳新,喻愛林,謝谷艾

1 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心；南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,南京 210037 2 江西省林業(yè)科學(xué)院,南昌 330013 3 南京中山陵園管理局,南京 210014

1888年,Beijerinck首次分離出具有固氮活性的微生物,1893年Glatz分離出厭氧型固氮梭菌,這些工作開創(chuàng)了研究生物固氮和固氮微生物的科學(xué)領(lǐng)域[1]。1912年P(guān)eklo從蚜蟲體內(nèi)分離獲得固氮菌[2],此后不同作者陸續(xù)開展了白蟻[3- 5]、蚜蟲[6]、小蠹蟲[2]、藥材甲、谷盜、衣蛾、果蠅[7]等共生菌固氮能力的研究。由于缺乏高精度檢測儀器,這些早期研究并未提供動(dòng)物共生菌固氮的有力證據(jù)。這種局面直到乙炔還原法的出現(xiàn)才得以改變,乙炔還原法為生物固氮研究提供了簡便準(zhǔn)確的檢測方法,首先在白蟻共生菌固氮檢測中獲得成功[8- 9]。此后,針對不同昆蟲的類似工作陸續(xù)展開[10- 11]。不僅測定固氮酶活性,還對消化道內(nèi)的共生固氮菌進(jìn)行分離鑒定[12- 13]。動(dòng)物共生固氮研究的另一重要進(jìn)展是分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,從而克服了許多固氮菌不能分離培養(yǎng)的局限。鉬鐵蛋白和鐵蛋白固氮酶系統(tǒng)中鐵蛋白由nifH基因編碼,nifH基因高度保守,對其檢測可用于固氮菌類群鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[14]。雖然國外對動(dòng)物共生菌固氮的研究已逾百載,但國內(nèi)的相關(guān)研究尚處于起步階段。黃小芳等[1]、王亞召等[14]曾分別撰文介紹海洋動(dòng)物和白蟻共生菌固氮的研究情況。本文從動(dòng)物共生菌固氮涉及的動(dòng)物和微生物類群、動(dòng)物共生菌固氮的性質(zhì)和機(jī)理等角度,介紹動(dòng)物共生菌固氮的研究進(jìn)展。

1 共生菌固氮涉及的動(dòng)物類群

一般認(rèn)為,動(dòng)物共生菌固氮現(xiàn)象主要存在于貧氮營養(yǎng)型動(dòng)物,如珊瑚、白蟻、船蛆、食木鯰魚等。但已報(bào)道具有固氮酶活性或具有固氮酶基因的動(dòng)物已遠(yuǎn)超上述范疇,涉及的動(dòng)物包括海綿、珊瑚、蚯蚓、磷蝦、馬陸、昆蟲、蝸牛、船蛆、松雞、奶牛、山羊、豬、河貍、沙鼠、豚鼠、人類等。據(jù)本文統(tǒng)計(jì),已報(bào)道共生菌固氮?jiǎng)游镉?門13綱23目50科99屬174種(見表1) 。

表1 已報(bào)道的共生菌固氮?jiǎng)游?

▲：乙炔還原法；◆：固氮酶基因檢測；★：15N同位素檢測；●：固氮菌分離鑒定

從海綿到人類,涉及低等到高等多種動(dòng)物類群。其中有貧氮營養(yǎng)型動(dòng)物,也有雜食性動(dòng)物。表1所列174種動(dòng)物中,多孔動(dòng)物門2種(1.15%),刺胞動(dòng)物門17種(9.77%),線蟲動(dòng)物門1種(0.58%),環(huán)節(jié)動(dòng)物門9種(5.17%),節(jié)肢動(dòng)物門113種(64.94%),軟體動(dòng)物門11種(6.32%),脊索動(dòng)物門21種(12.07%)。節(jié)肢動(dòng)物種類最多,其次為脊索動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、軟體動(dòng)物和環(huán)節(jié)動(dòng)物,多孔動(dòng)物和線蟲動(dòng)物僅有少量研究。節(jié)肢動(dòng)物113種中昆蟲綱109種,占96.5%。昆蟲綱中等翅目75種,占昆蟲綱種類的68.8%；鞘翅目18種,占16.5%；膜翅目13種,占11.9%。脊索動(dòng)物21種中,輻鰭魚綱1種,鳥綱2種,哺乳綱18種。刺胞動(dòng)物17種全部為珊瑚綱種類,其中石珊瑚目16種,柳珊瑚目1種。

2 動(dòng)物共生固氮菌的類群特點(diǎn)

2.1 常見種類

表2所列52種動(dòng)物所涉及固氮菌87屬137種,大多數(shù)種類屬于細(xì)菌,也有少數(shù)古菌,如Methanobacteriumivanovii[94]和魯米葉甲烷馬賽里球菌[93]。水生動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)有藻類[24,49]。按出現(xiàn)頻次,表2所列固氮菌中常見種類有慢生根瘤菌Bradyrhizobiumsp.(8次)、腸桿菌Enterobactersp.(7次)、肺炎克雷伯氏菌(6次)、葡萄球菌Staphylococcussp.(5次)、腸桿菌Enterobacteriaceaesp.(5次)、鏈球菌Streptococcussp.(4次)、法氏檸檬酸桿菌(4次)。出現(xiàn)3次的有11種,分別為圓褐固氮菌、擬桿菌Bacteroidessp.、芽孢桿菌Bacillussp.、巴氏固氮梭菌、催娩克雷白氏菌、Klebsiellasp.、甲基孢囊菌Methylocystissp.、根瘤菌Rhizobiumsp.、紅球菌Rhodococcussp.、中華根瘤菌Sinorhizobiumsp.、密螺旋體Treponemasp.。出現(xiàn)2次的有23種。出現(xiàn)1次的96種,約占全部種類的70%。多數(shù)種類僅出現(xiàn)1次,表明研究的動(dòng)物種類仍然較少,發(fā)現(xiàn)的固氮菌種類較為分散,實(shí)際蘊(yùn)含的種類資源可能更為豐富(表2中固氮菌生態(tài)類型劃分為：A：植物共生固氮菌；B：植物內(nèi)生固氮菌；C：植物根際固氮菌；D：自生固氮菌；AB：植物共生/植物內(nèi)生固氮菌；AD：植物共生/自生固氮菌；BC：植物內(nèi)生/植物根際固氮菌；BD：植物內(nèi)生/自生固氮菌)[102-116]。

表2 動(dòng)物共生固氮菌種類與生態(tài)類型

Table 2 The Species and ecological types of animal symbiotic nitrogen xation bacteria

表2 動(dòng)物共生固氮菌種類與生態(tài)類型

宿主/固氮菌種類/文獻(xiàn)來源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sources宿主/固氮菌種類/文獻(xiàn)來源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sources多孔動(dòng)物門Porifera、尋常海綿綱 DemospongiaeNasutitermes graveolus/Enterobacter sp., Staphylococcus sp.[13]Ircinia strobilina, Mycale laxissima/DAzotobacter chroococum, DDesulfovibrio salexigens, Leptolyngbya sp., Methylocystis sp., Myxosarcina sp., Tolypothrix sp., Trichodesmium thiebautii[18]Nasutitermes nigriceps/Ensifer sp.[70]刺胞動(dòng)物門Cnidaria、珊瑚綱AnthozoaNeotermes castaneus/Arthrobacter sp., Bacteroides. Enterobacteriaceae, Myxobacterales, CStaphylococcus sp.[90]Acropora millepora/Alphaproteobacteria sp., Bradyrhizobium sp.,Cyanobacteria sp., Deltaproteobacteria sp., Desulfuromonas sp.,Gammaproteobacteria sp., Myxosarcina sp., Sinorhizobium sp., Xenococcus sp.[23]Macrotermes sp./Azotobacter sp., Beijerinckia sp., DClostridium pasteur-ianumm, Klebsiella sp.[60]A. robusta/Bradyrhizobium sp., Paenibacillus durus, Rhizobium sp., Sinorhizobium sp.[27]Odontotermes formosanus/BDKlebsiella pneumoniae[95]; BKlebsiella variicola[80]Pocillopora damicornis, Acropora millepora, A. muricata/Bradyrhizobium sp., Cylindrospermopsisraciborskii, DDesulfovibrio salexigens, Dickeya dadantii, Methylobacter luteus, Methylocystis echinoides, Nodularia spumigena, Trichodesmium erythraeum, Wolinella succinogenes[25]Odontotaenius disjunctus/Paludibacter propionicigenes[88]Montipora capitata, M. flabellata/BAcetobacter diazotrophicus,DAzomonas agilis, BDA. macrocytogenes, BCAzospirillum lipoferum, DAzotobacter chroococcum, DA. vineladii, Bradyrhizobium sp.,Desulfobacter latus, Halorhodospira halophila, Marichromatium purpura-tum, AMesorhizobium loti[35]Conorhynchus pistor/BDKlebsiella pneumonia[17]Porites lutea/Acetobacterium woodii, ABradyrhizobium japonicum, ABBurkholderia cepacia, Chroococcidiopsis sp., CClostridium themocel-lum, Ideonella sp., Leptolyngbya minuta, L. nodulosa, Marichromatum purpuratum, CPseudomonas stutzeri[49]Dendroctonus frontalis, D. terebrans, Ips avulsus/Enterobacter aerogenes, BE. agglomerans, E. sp.[20]Pocillopora damicornis/BCAzospirillum brasilensis, ABradyrhizobium denitrificans, B. sp., Chlorobium limicola, C. phaeobacteroides,BKlebsiella pneumoniae, Klebsiella sp., ARhizobium rosettiformans, Sinorhizobium sp., Teredinibacter turnerae[49]; DAzotobacter chroococcum, BCAzospirillum halopraeferens, ABradyrhizobium denitrificans, Klebsiella sp., CPseudomonas stutzeri, Rhizobium sp.[96]Dendroctonus valens, D. rhizophagus /DRaoultella terrigena[21]環(huán)節(jié)動(dòng)物門Annelida、寡毛綱 ClitellataBactrocera tryoni/BCKlebsiella oxytoca[31]Pheretima vittata/BCKlebsiella oxytoca[63]Ceratitis capitata/DCitrobacter freundii, Enterobacter sp., Erwinia amylo-vara, BCKlebsiella planticola, BDK. pneumoniae, BCK. oxytoca, Pectobacte-rium carotovora, P. cypripedii, BPantoea agglomerans[34]節(jié)肢動(dòng)物門Arthropoda軟甲綱Malacostraca、磷蝦目Euphausiacea;甲殼綱Crustacea、橈足亞綱 CopepodaAcromyrmex octospinosus/Rhizobiales[39]Euphausia sp., Copepods/Chlorobium tepidum, DChromatium purpuratum, Desulfobacter curvatus, Desulfonema limicola[66]Tetraponera binghami/Burkholderia sp., Flavobacterium sp., Rhizobium sp., Methylobacterium sp., Pseudomonas sp.[51]昆蟲綱Insecta軟體動(dòng)物門Mollusca、雙殼綱BivalviaCryptocercus punctulatus/Desulfovibrio sp.[75]Lyrodus pedicellatus/Teredinibacter turnerae[97]Mastotermes darwiniensis/DCitrobacter freundii[12]; Enterobacter sp., Flavobacterium sp., Streptococcus sp.[13]; Desulfovibrio sp.[22]脊索動(dòng)物門Chordata、輻鰭魚綱ActinopterygiiZootermopsis angusticollis/Treponema sp.[98]Panaque nigrolineatus/BDAzomonas macrocytogenes, AAzorhizobium doebere-inerae, ABradyrhizobium japonicum, B. sp., Cellulosilyticum lentocellum, CClostridium arbusti, C. beijerinckii, CC. papyrosolvens, CC. tyrobutyricum, Desulfomonile tiedjei,Methylocystis parvus, M. sp., Opitutaceae, ASinorhizobium meliloti, CSphingomonas azotifigens[67]Cryptotermes primus/Enterobacter sp., Streptococcus sp.[13]脊索動(dòng)物門Chordata、哺乳綱MammaliaCoptotermes formosanus/BEnterobacter agglomerans[99]; Acinetobacter sp., BDKlebsiella pneumonia[100]Bos tauru/Acinetobacter baumannii, BCBacillus methylotrophicus, BB. sonorensis, CStaphylococcus caprae[72]Coptotermes lacteus/DCitrobacter freundii[12];Enterobacter sp., Strepto-coccus sp.[13]Susscrofa domestica, Cavia porcellus/BCEnterobacter cloacae, Klebsiella aero-genes[79]

表2 動(dòng)物共生固氮菌種類與生態(tài)類型

續(xù)表宿主/固氮菌種類/文獻(xiàn)來源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sources宿主/固氮菌種類/文獻(xiàn)來源Host/Types of symbiotic nitrogen-fixing bacteria/Literature sourcesHeterotermes ferox/Enterobacter sp., Streptococcus sp.[13]Ochotona hyperborea/Bradyrhizobium sp., Bryantella formatexigens, Clos-tridium cellulovorans, DC. pasteurianum, Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes, Sphingomonas sp., Treponema sp.[101]H. indicola/Desulfovibrio termitidis[22]Ochotona dauurica, Ochotona hyperborea, Ochotona mantchurica/Bradyrhi-zobium sp., Bryantella formatexigens, Clostridium cellulovorans, Fibrobacter succinogenes, Sphingomonas sp., Treponema sp.[89]Reticulitermes lucifugus/Bacillus sp., Enterobacteriaceae, Erwinia sp., Rhodococcus sp., CStaphylococcussimulans, CS. haemolyticus[33]Meriones meridianus, M. tamariscinus/Bacillus sp., Corynebacterium sp., Enterobacteriaceae sp.[82]Reticulitermes flavipes/Desulfovibrio desulfuricans[22]Microtus rossiaemeridionalis/Arthrobacter sp., Bacillus cereus, BB. licheniformis, BCB. subtilis, Bacteroides sp., Curtobacterium sp., Mi-crococcus sp., Myxococcales, Rhodococcus sp., Staphylococcus sp. [84]Reticulitermes speratus/DClostridium pasteurianum, Desulfovibrio gigas, Methanobacterium ivanovii[94]Clethrionomys glareolus/BBacillus licheniformis, BCB. subtilis, Bacteroides sp., Enterobacteriaceae, Micrococcus sp., Myxococcales, Nocardia sp.[84]Nasutitermes exitiosus/DCitrobacter freundii, Staphylococcus sp.[13]Homo sapiens/BCEnterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes[79]; Coprococcus catus, C. comes, Desulfitobacterium hafniense, Eubacterium hallii, E. sp., BDKlebsiella pneumoniae, Lachnospira multipara, Methylocystis sp., Megas-phaera elsdenii, Methanomassiliicoccus luminyensis, Ruminococcus obeum, Pyramidobactor piscolens, Roseburia sp.[93]

2.2 動(dòng)物共生固氮菌的生態(tài)類型多樣性

表2所列動(dòng)物共生固氮菌種類,涵蓋植物固氮菌和自生固氮菌等多種生態(tài)類型。其中40種曾作為植物共生固氮菌、植物內(nèi)生固氮菌、植物根際固氮菌、自生固氮菌予以報(bào)道。植物共生固氮菌6種：德式固氮根瘤菌、Bradyrhizobiumdenitrificans、慢生大豆根瘤菌、百脈根中生根瘤菌、Rhizobiumrosettiformans、苜蓿中華根瘤菌。植物內(nèi)生固氮菌7種：固氮醋桿菌、巨胞氮單胞菌、地衣芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、聚團(tuán)腸桿菌、變棲克雷伯氏菌、成團(tuán)泛菌。植物根際固氮菌8種：熱纖梭菌、溶紙莎草梭菌、酪丁酸梭菌、斯氏假單胞菌、Sphingomonasazotifigens、山羊葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、模仿葡萄球菌。自生固氮菌8種：敏捷氮單胞菌、圓褐固氮菌、棕色固氮菌、著色菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏固氮梭菌、需鹽脫硫弧菌、土生拉烏爾菌。植物共生/內(nèi)生固氮菌1種,即洋蔥伯克霍爾德菌。植物內(nèi)生/根際固氮菌8種：巴西固氮螺菌、高鹽固氮螺菌、生脂固氮螺菌、甲基營養(yǎng)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、陰溝腸桿菌、 植生克雷白氏菌、催娩克雷伯氏菌。植物內(nèi)生/自生固氮菌2種：巨胞氮單胞菌和肺炎克雷伯氏菌。

2.3 固氮菌的生態(tài)類型轉(zhuǎn)換

在固氮菌中較為常見,兼性內(nèi)生固氮菌,如一些固氮螺菌屬細(xì)菌,既能在根內(nèi)也能在根表和土壤中定殖[117]。表2中洋蔥伯克霍爾德菌兼具植物共生固氮[102]和植物內(nèi)生固氮能力[118]。巨胞氮單胞菌既是胡楊的內(nèi)生固氮菌[114],又是自生固氮菌[115]。Frohlich等[70]用象白蟻Nasutitermesnigriceps腸道分離獲得的劍菌培養(yǎng)物,對12種豆科植物進(jìn)行接種試驗(yàn),在豌豆、印度田菁、葫蘆巴上均形成了根瘤,證實(shí)動(dòng)物腸道固氮菌和植物共生固氮菌之間存在生態(tài)類型的轉(zhuǎn)化。賓氏細(xì)長蟻中、后腸結(jié)合部有菌囊,菌囊外密布?xì)夤芎婉R氏管。囊內(nèi)含有伯克霍爾德菌、黃質(zhì)菌、根瘤菌、甲基桿菌、假單胞菌[51]。伯克霍爾德菌屬于植物共生和自生固氮菌,黃質(zhì)菌可營植物內(nèi)生固氮,根瘤菌則屬于植物共生/植物內(nèi)生和自生固氮菌,甲基桿菌是植物共生固氮菌常見類群,假單胞菌在植物共生/植物內(nèi)生/植物根際固氮菌中常有發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果表明螞蟻體內(nèi)菌囊的內(nèi)部環(huán)境似乎比固氮植物的根瘤更復(fù)雜,能包容許多固氮菌種類。一些不能形成植物根瘤的種類,如黃質(zhì)菌,在菌囊內(nèi)也能正常發(fā)育。

3 動(dòng)物共生固氮菌的來源

但用熒光標(biāo)記的聚團(tuán)腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌飼喂地中海果蠅成蟲,在成蟲消化道和卵表以及幼蟲和蛹的消化道均檢出上述細(xì)菌的存在[124]。說明腸道共生固氮菌也存在成蟲-卵之間的垂直傳遞。Ayayee等在經(jīng)過表面滅菌處理的光肩星天牛卵內(nèi)檢測到脲酶、固氮酶基因及其轉(zhuǎn)錄活性,表明脲分解細(xì)菌和固氮菌存在通過遺傳進(jìn)行垂直傳遞的可能性[28]。

4 動(dòng)物共生菌固氮的性質(zhì)

一般認(rèn)為動(dòng)物腸道共生菌固氮屬于聯(lián)合固氮,柯為稱白蟻腸道內(nèi)固氮菌是一種“聯(lián)合共生固氮形式”在動(dòng)物界的出現(xiàn)[125]。祁永青等則將聯(lián)合固氮菌定義為“必須生活在植物根際、葉面或動(dòng)物腸道等處才能固氮的原核生物”[126]。另外有珊瑚和固氮細(xì)菌的互作聯(lián)合固氮,如石珊瑚和固氮菌屬的聯(lián)合固氮,海洋藍(lán)藻與海綿屬形成內(nèi)共生關(guān)系,蛤類與藍(lán)藻、固氮菌的聯(lián)合固氮[127]。此外,動(dòng)物共生固氮菌固氮活性容易受環(huán)境影響,也具有較明顯的聯(lián)合固氮特征。白蟻種類、品級以及不同季節(jié)等均影響固氮活性,其中食物含氮量為主要影響因子,其他因子在不同程度上也可溯及食物含氮量的關(guān)系[14]。食性對固氮活性的影響一般表現(xiàn)為低等食木白蟻固氮活性強(qiáng),高等培菌白蟻和食土白蟻固氮活性弱或沒有活性[14]。在食料中添加(NH4)2SO4或KNO3均能顯著減低臺(tái)灣乳白蟻工蟻腸道共生固氮菌的固氮能力[9]。已經(jīng)分離獲得的固氮菌中,許多種類屬于兼性厭氧菌、生境較為廣泛,似乎與白蟻構(gòu)成專性共生的可能性不大[14]。Vecherskii等對歐洲散白蟻共生菌固氮研究表明：活體和蟻巢物質(zhì)在好氧和厭氧條件下均有固氮酶活性,白蟻腸道內(nèi)細(xì)菌群落與蟻巢物質(zhì)的類似[33]。因此認(rèn)為該種白蟻與共生固氮菌之間關(guān)系屬于聯(lián)合固氮作用。但也有研究表明動(dòng)物腸道有特殊的含菌構(gòu)造,如賓氏細(xì)長蟻中、后腸結(jié)合部有類似于根瘤的菌囊,囊內(nèi)含有多種固氮菌[51]。此外,固氮酶基因檢測表明,動(dòng)物腸道固氮菌區(qū)系十分豐富,能夠分離培養(yǎng)的僅為其極少部分,不能排除專性共生體系的存在。

5 動(dòng)物共生菌固氮的微生境與共生復(fù)合體

5.1 動(dòng)物共生菌固氮的微生境

氧氣、氫氣、pH和氧化還原電位等是腸道微生境的主要指標(biāo),在腸道不同部位這些指標(biāo)存在明顯差異,形成多樣化的微生境,供不同生理需求的固氮菌生長發(fā)育。低等白蟻大多數(shù)腸道微生物位于后腸前段膨大的后腸囊內(nèi)。高等白蟻腸道區(qū)室化有逐漸復(fù)雜化的趨勢,食土白蟻后腸膨大形成連續(xù)的5個(gè)囊室,相鄰囊室之間以肌肉閥瓣分隔。消化道不同部位以及不同的后腸囊內(nèi)氧氣、氫氣、pH和氧化還原電位均有差異[128]。黃肢散白蟻和象白蟻的后腸囊氧氣濃度分布呈現(xiàn)兩個(gè)不同區(qū)域,外側(cè)為微氧層,約占后腸囊體積的60%,其中生活的共生菌消耗掉向腸道內(nèi)擴(kuò)散的氧氣,形成氧阱,造成后腸囊中心部分(40%)嚴(yán)格的厭氧環(huán)境。與此相反,后腸囊中心部位氫氣濃度最高,并通過兩個(gè)區(qū)域消耗氫氣,抑制其向外擴(kuò)散。一個(gè)區(qū)域是臨近后腸囊中心部位的腸腔區(qū)域,另一個(gè)是后腸壁區(qū)域。氧氣和氫氣的上述分布特點(diǎn)使厭氧和微好氧微生物各得其所,中心部分嚴(yán)格的厭氧環(huán)境是發(fā)酵生成乙酸酯的場所,而乙酸酯是宿主昆蟲的主要能源物質(zhì)[129]。具角黑艷甲成蟲的消化道分為前腸、中腸、前后腸和后后腸4段,每段中心部位均有一個(gè)厭氧核心區(qū),由此向外氧氣含量逐漸增高。放線菌和根瘤菌主要分布于前腸和后后腸。前后腸內(nèi)表面腸壁細(xì)胞形態(tài)分化最大,形成密集的胞窩和棘刺,將空間進(jìn)一步區(qū)室化供細(xì)菌、原生動(dòng)物、線蟲等定殖,其中擬桿菌和梭菌為主要類群。該部位還是產(chǎn)甲烷古菌的唯一分布區(qū)域和共生菌固氮核心部位[130]。

5.2 共生復(fù)合體

固氮菌一般與多種生物形成復(fù)合體,以滿足固氮過程的能源和固氮產(chǎn)物同化等方面的需求。臺(tái)灣乳白蟻與后腸的偽披發(fā)蟲Pseudotrichonymphagrassii、偽披發(fā)蟲內(nèi)生菌Azobacteroidespseudotrichonymphae形成三重共生關(guān)系。食物通過口器和前腸粉碎、中腸消化吸收后,形成較為純粹的木質(zhì)纖維素微粒,這些微粒成為偽披發(fā)蟲的食料,經(jīng)偽披發(fā)蟲分解后形成能量物質(zhì),為白蟻和固氮菌利用。A.pseudotrichonymphae則主要負(fù)責(zé)固氮和氮素營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化,為披發(fā)蟲和白蟻提供氮素營養(yǎng)[16]。隱尾蠊后腸內(nèi)原生動(dòng)物披發(fā)蟲Barbulanympha體表有許多外共生的擬桿菌,這些外共生菌具有固氮能力,與隱尾蠊、披發(fā)蟲構(gòu)成三重共生復(fù)合體[75]。豬毛菜屬的Salsolainermis為旱生植物,與錐喙象以及錐喙象腸道固氮菌肺炎克雷伯氏菌形成三重共生。象甲形成緊密附著在植物根部的土室,以此獲得碳素、水分等營養(yǎng)并躲避敵害,肺炎克雷伯氏菌通過共生固氮提供氮素營養(yǎng),并促進(jìn)植物生長[17]。固氮菌一般與纖維素分解菌協(xié)同作用,以滿足各自對能量和氮素營養(yǎng)的需求。將黑翅土白蟻腸道分離的纖維素分解菌與固氮菌混合培養(yǎng),纖維素酶活性與固氮酶活性均有顯著提高[131]。從奶牛瘤胃中分離的纖維素分解菌和固氮菌進(jìn)行混合體外發(fā)酵,混合菌株的添加對瘤胃的發(fā)酵也具有促進(jìn)作用[132]。纖維素分解和固氮也可在同一種細(xì)菌體內(nèi)完成。船蛆鰓上著生有Deshayes腺,腺體細(xì)胞內(nèi)的船蛆桿菌既可分解木質(zhì)纖維素,也可固氮[59,61]。

6 動(dòng)物共生菌固氮產(chǎn)物的同化

6.1 動(dòng)物體內(nèi)氨同化途徑

氨既是共生固氮的產(chǎn)物,對組織細(xì)胞也具有毒害作用,必須轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮素營養(yǎng)或及時(shí)清除。氨轉(zhuǎn)化為含氮有機(jī)物主要有4種途徑：(1)谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)途徑：氨與谷氨酸(Glu)在GS催化下生成谷氨酰胺(Gln),Gln在GOGAT催化下將氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸,生成2分子Glu。GS有3類：GSⅠ主要存在于細(xì)菌；GSⅡ主要存在于植物共生細(xì)菌以及真核細(xì)胞中；GSⅢ發(fā)現(xiàn)于專性厭氧桿菌、一些厭氧細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌。GS/GOGAT對氨的親和性高,主要在低氨濃度時(shí)發(fā)揮作用。(2)谷氨酸脫氫酶(GDH)途徑：氨與α-酮戊二酸在GDH催化下生成Glu。GDH有兩種,NAD-GDH降解谷氨酸,NADP-GDH用于谷氨酸的合成。GDH在高氨濃度時(shí)占主導(dǎo)作用。(3)丙氨酸脫氫酶(ADH)途徑：ADH催化丙酮酸和銨生成丙氨酸；(4)天冬氨酸酶途徑：催化延胡索酸和銨生成天冬氨酸[133]。

6.2 反芻動(dòng)物瘤胃氨的同化

主要由細(xì)菌和真菌完成,瘤胃細(xì)菌可分為發(fā)酵結(jié)構(gòu)性碳水化合物和發(fā)酵非結(jié)構(gòu)性碳水化合物兩類,前者僅能利用氨作為氮源,后者則可利用氨、氨基酸和肽作為氮源。結(jié)構(gòu)性碳水化合物主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。瘤胃纖維分解菌對氨氮的利用主要是通過GDH和ADH途徑。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物包括水溶性碳水化合物,如單糖、雙糖、低聚糖和一些多糖,以及不溶于水的大分子多糖。非纖維分解菌對氨氮的利用主要是通過GDH路徑和GS路徑,可以從頭合成多種自身所需氨基酸,且大多數(shù)不存在GOGAT路徑。瘤胃厭氧真菌缺乏蛋白質(zhì)降解能力,可以以氨為唯一氮源合成自身所需氨基酸滿足生長需求。GDH和GS-GOGAT途徑是瘤胃真菌同化氨的2條主要路徑[133]。

6.3 珊瑚體內(nèi)氨的同化

珊瑚對氨的同化由腸壁細(xì)胞與蟲黃藻協(xié)同完成,蟲黃藻位于珊瑚腸壁細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi),能通過光合作用為珊瑚提供能量,還能通過GS/GOGAT途徑將氨轉(zhuǎn)化為氨基酸(見圖1)。環(huán)境中的氨經(jīng)珊瑚腸腔進(jìn)入腸壁細(xì)胞質(zhì),再進(jìn)入蟲黃藻細(xì)胞質(zhì),通過GS/GOGAT途徑轉(zhuǎn)化為Gln和Glu。所形成的Gln、Glu可以直接轉(zhuǎn)移進(jìn)入珊瑚腸壁細(xì)胞質(zhì),進(jìn)而轉(zhuǎn)化為其他氨基酸,合成蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)代謝形成的氨又可擴(kuò)散進(jìn)入腸腔,再次吸收利用或排出體外。腸壁細(xì)胞質(zhì)也存在GS/GOGAT途徑和GDH途徑,但轉(zhuǎn)化速率明顯低于蟲黃藻共生體[135]。

圖1 珊瑚-蟲黃藻共生體氨同化吸收模型[135]Fig.1 Model of ammonium assimilation in the coral-dinoflagellate symbiosis

6.4 白蟻體內(nèi)纖維素分解、生物固氮與氨同化

6.4.1臺(tái)灣乳白蟻-偽披發(fā)蟲-內(nèi)生菌復(fù)合體

臺(tái)灣乳白蟻后腸有原生動(dòng)物偽披發(fā)蟲Pseudotrichonymphagrassii,偽披發(fā)蟲有內(nèi)生菌Azobacteroidespseudotrichonymphae。后腸內(nèi)的木質(zhì)纖維素顆粒被偽披發(fā)蟲吞噬,降解為葡萄糖、木糖、糖醛酸等,進(jìn)一步發(fā)酵形成CO2和H2,降解產(chǎn)物從批發(fā)蟲細(xì)胞進(jìn)入腸腔,在產(chǎn)酸菌作用下形成乙酸酯,成為能量物質(zhì)。內(nèi)生菌則發(fā)揮固氮和氮轉(zhuǎn)化功能。披發(fā)蟲細(xì)胞本身缺乏脲酶和GS,固氮形成的氨必須在內(nèi)生菌體內(nèi)GS催化下生成Gln,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為其他氨基酸和輔因子。菌體內(nèi)形成的氨基酸進(jìn)入披發(fā)蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行含氮有機(jī)物轉(zhuǎn)化,所形成的脲和氨再進(jìn)入菌體內(nèi)進(jìn)行Gln和氨基酸合成(圖2)[16]

圖2 臺(tái)灣乳白蟻-偽披發(fā)蟲-內(nèi)生菌復(fù)合體共生作用模型[134]Fig.2 Model of symbiosis among Coptotermes formosanus, Pseudotrichonympha grassii and its endosymbiotic bacteria

6.4.2棲北散白蟻-固氮菌-披發(fā)蟲-白蟻菌群-1(TG1)復(fù)合體

棲北散白蟻后腸內(nèi)有原生動(dòng)物披發(fā)蟲Trichonymphaagilis,披發(fā)蟲內(nèi)生菌為白蟻菌群1(TG1),后腸腸腔內(nèi)還有共生固氮菌。木質(zhì)纖維素顆粒在披發(fā)蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分解形成葡萄糖- 6-磷酸等碳水化合物,并形成CO2、H2、乙酸酯等代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物進(jìn)入腸腔,在產(chǎn)酸菌作用下形成乙酸酯。腸腔內(nèi)固氮菌形成的氨,可以被披發(fā)蟲吸收,經(jīng)過GS途徑合成Gln后進(jìn)入TG1菌體內(nèi),轉(zhuǎn)化為氨基酸和輔因子(見圖3)。后腸腸腔內(nèi)的營養(yǎng)物、披發(fā)蟲、細(xì)菌組成的營養(yǎng)液,可能通過肛交哺和糞食性,被蟻巢內(nèi)不同個(gè)體分享[136]。

圖3 棲北散白蟻-固氮菌-披發(fā)蟲-白蟻菌群- 1(TG1)復(fù)合體共生作用模型[136]Fig.3 Model of symbiosis among Reticulitermes speratus, symbiotic nitrogen-fixing bacteria, Trichonympha agilis and TG1

6.4.3白蟻共生菌固氮產(chǎn)物的吸收路徑

Bentley用15N2作為氮源培養(yǎng)Nusutitermescorniger工蟻和兵蟻,24h后分別檢測腸道、頭部、蟲體其他部分固氮產(chǎn)物含量,發(fā)現(xiàn)三類樣品中均有固氮產(chǎn)物檢出,證實(shí)了共生菌固氮與產(chǎn)物同化現(xiàn)象[64]。不同部位固氮產(chǎn)物含量：工蟻為腸道>蟲體其他部分>頭部,兵蟻為腸道>頭部>蟲體其他部分。腸道為固氮產(chǎn)物的最初形成場所,固氮產(chǎn)物可以通過交哺在工蟻和兵蟻個(gè)體間轉(zhuǎn)移,從工蟻向兵蟻的轉(zhuǎn)移為主流方向。Fujita 等對棲北散白蟻的研究表明：溶菌酶活性主要分布于唾腺,前腸的溶菌酶來源于唾腺[137]。蛋白酶活性和游離氨基酸含量中腸最高。推測棲北散白蟻通過唾腺分泌的溶菌酶分解肛交哺獲得的含菌后腸液,而溶菌酶進(jìn)入中腸后被中腸蛋白酶分解失活,在后腸中活性很低,對后腸共生菌群較安全。此后,Fujita 等采用15N2示蹤對棲北散白蟻生物固氮產(chǎn)物同化途徑進(jìn)行研究,固氮產(chǎn)物主要出現(xiàn)在后腸,其次為嗉囊與中腸,在頭部以及蟲體其他部分也有檢出[36]。后腸、嗉囊與中腸內(nèi)固氮產(chǎn)物首先出現(xiàn),一段時(shí)間后,頭部和蟲體其他部分也出現(xiàn)固氮產(chǎn)物的蹤跡。據(jù)此認(rèn)為,大部分固氮產(chǎn)物的同化吸收并不是在后腸完成的,而是通過肛交哺轉(zhuǎn)移到前腸,在前腸和中腸完成酶解和吸收過程。

7 共生菌固氮在動(dòng)物氮素營養(yǎng)中的地位

動(dòng)物氮素營養(yǎng)可以來自于食物、非蛋白氮以及共生菌固氮,其中非蛋白氮指氮素營養(yǎng)代謝形成的產(chǎn)物,如尿素及其衍生物、氨及銨鹽、酰胺化合物等,非蛋白氮?jiǎng)游锊荒苤苯永?但可作為共生菌的氮源,經(jīng)共生菌轉(zhuǎn)化后再次為動(dòng)物利用。反芻動(dòng)物的尿素在瘤胃中被細(xì)菌脲酶迅速水解成氨,部分氨參與瘤胃內(nèi)微生物蛋白的合成,最終成為動(dòng)物的氨基酸營養(yǎng)。另部分氨經(jīng)由瘤胃擴(kuò)散進(jìn)入靜脈,隨血液在肝臟處經(jīng)鳥氨酸循環(huán)再次合成尿素。肝臟合成的尿素被稱作內(nèi)源尿素,部分內(nèi)源尿素可經(jīng)由唾液或者血液再次返回到瘤胃內(nèi),被瘤胃細(xì)菌重新利用[139-140]。

鱗翅目、雙翅目、脈翅目等全變態(tài)昆蟲,在老熟幼蟲、預(yù)蛹或預(yù)成蟲階段,則通過臨時(shí)貯存非蛋白氮,將其轉(zhuǎn)化為氨,合成新的氨基酸和蛋白質(zhì)以滿足結(jié)繭等特殊行為的需求[140-141]。棲北散白蟻將尿酸貯存在脂肪體尿鹽細(xì)胞內(nèi),需要?jiǎng)佑脮r(shí),尿鹽釋入血淋巴,被馬氏管攝取后排泄進(jìn)入后腸腔,在后腸共生細(xì)菌作用下分解為氨,通過氨的同化進(jìn)入氮素營養(yǎng)循環(huán)[142]。

氨不僅對生物固氮具有氨阻遏效應(yīng),對細(xì)胞還具有毒性,動(dòng)物體內(nèi)氮素代謝涉及營養(yǎng)和解毒等許多方面。通過食物氮、非蛋白氮以及生物固氮相互協(xié)調(diào),形成營養(yǎng)和解毒的代謝網(wǎng)絡(luò),共同維持動(dòng)物體內(nèi)氮素營養(yǎng)的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)食物中蛋白質(zhì)營養(yǎng)豐富,非蛋白氮代謝產(chǎn)物含量高,動(dòng)物體以解毒排泄為主,非蛋白氮的再利用以及生物固氮處于抑制狀態(tài)；貧氮營養(yǎng)型動(dòng)物,則通過非蛋白氮的循環(huán)利用和生物固氮,補(bǔ)充食物中氮素營養(yǎng)的不足。這些貧氮營養(yǎng)型動(dòng)物,如白蟻、珊瑚、食草動(dòng)物等,一般具有較高的共生菌固氮活性。生物固氮需要消耗很多能量,大量能源物質(zhì)應(yīng)用于氮素營養(yǎng)的合成,勢必影響動(dòng)物體內(nèi)的能量權(quán)衡。因此,即使是具有共生菌固氮能力的白蟻,也依然對富氮營養(yǎng)食物表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨性。取食含氮量高的食物時(shí),體內(nèi)共生固氮量下降[65]。

8 結(jié)語

一般認(rèn)為,動(dòng)物的共生菌固氮主要存在于貧氮營養(yǎng)型動(dòng)物,但現(xiàn)有報(bào)道涉及的動(dòng)物達(dá)到7門13綱23目50科99屬174種,已遠(yuǎn)超上述范圍。從海綿到人類,涉及低等到高等多種動(dòng)物類群。雖然其中有些種類僅為固氮酶基因檢出的結(jié)果,這些基因表達(dá)情況還有待進(jìn)一步確認(rèn),但共生菌固氮可能是動(dòng)物中普遍存在的現(xiàn)象。所涉及的固氮菌類群也十分豐富,其中大多數(shù)種類為細(xì)菌,也有少數(shù)古菌和藻類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物共生固氮菌種類與植物固氮菌具有明顯的交叉性,植物共生固氮菌、植物內(nèi)生固氮菌、植物根際固氮菌和自生固氮菌在不同動(dòng)物腸道內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)。這些情況似乎表明生物固氮可能具有統(tǒng)一的固氮菌資源庫,同一種固氮菌與植物共生、與動(dòng)物共生或者自由生活,只是固氮菌對生境的選擇,取決于環(huán)境條件是否能滿足特定固氮菌固氮活性表達(dá)的需要。如電子和質(zhì)子供體、能量供給、固氮酶活性保護(hù)以及解除氨阻遏等。這也表明動(dòng)物腸道具有豐富的微生境,能滿足不同固氮菌的生理需求。動(dòng)物共生固氮菌將會(huì)成為生物固氮資源開發(fā)的富礦,在生物固氮研究、發(fā)酵工業(yè)、動(dòng)物營養(yǎng)等領(lǐng)域展示其重要價(jià)值。

分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,對動(dòng)物共生固氮研究發(fā)揮了很大的促進(jìn)作用。但所發(fā)現(xiàn)的固氮菌資源以及固氮機(jī)理的理論模型,與具體情況的解釋驗(yàn)證還有相當(dāng)距離。動(dòng)物共生菌固氮過程一般由多種動(dòng)物和細(xì)菌組成的復(fù)合體,分別完成電子和質(zhì)子提供、能量保障、氧阱形成以及氨的同化等任務(wù)。目前對這些過程基本上還不了解。動(dòng)物共生固氮、植物共生固氮、自生固氮在固氮產(chǎn)物氨的同化方面均采用GS/GOGAT、GDH和ADH等途徑,但不同生物體內(nèi)相關(guān)途徑的酶系來源存在較大差異。動(dòng)物體內(nèi)氨同化酶系是否完全源于共生菌？酶系來源差異影響動(dòng)物營養(yǎng)代謝的機(jī)制如何等等,也是動(dòng)物共生固氮機(jī)理研究的基本問題。此外,動(dòng)物共生菌固氮的性質(zhì)也需要研究確認(rèn)?？傮w上,動(dòng)物通過食物攝取、非蛋白氮排泄或循環(huán)利用以及共生菌固氮等途徑,維持體內(nèi)氮素營養(yǎng)的平衡和氮素代謝末端產(chǎn)物的降解排泄,隨著研究的深入,將進(jìn)一步加深人們對氮素資源利用和動(dòng)物營養(yǎng)生理等方面的理解。