李寶紅，李盡文，歐陽貴錦，許月瑩，梁淇峰，黎梓蕊，李 莉

(廣東醫(yī)科大學東莞科研中心 藥學院，廣東 東莞 523808)

肝臟是重要而復雜的代謝生理器官，被喻為“人體最大的化工廠”。在我國，肝臟疾病發(fā)病率高且范圍廣，給人們的健康和生活造成了極大的危害和負擔[1]。因此，尋找有效的預防和治療因各種原因所致的肝損傷的藥物或功能食品，具有廣闊的前景和深遠的意義。

近些年來，隨著提取、純化工藝的迅速發(fā)展，天然產物藥物治療疾病得到大量學者的關注和認可，取得了很大進展；此類藥物具有多靶點、副作用小的特點，對有效預防和治療肝損傷的防治有一定的優(yōu)勢。朝鮮當歸(Angelica gigas Nakai)，味辛性溫，主要分布于韓國、朝鮮、日本及我國東北各省。紫花前胡素是香豆素類化合物，是朝鮮當歸的主要藥效成分，具有廣泛的藥理作用。研究表明，紫花前胡素可以用于治療白血病、糖尿病、高血壓、腎毒素以及腫瘤等，效果良好[2-3]。然而，目前紫花前胡素對四氯化碳(CCl4)誘導的急性肝損傷的作用鮮有報道。本研究擬采用CCl4誘導小鼠建立急性肝損傷模型，觀察紫花前胡素對急性肝損傷的影響，為其在藥物和保健品研發(fā)中的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

四氯化碳(CCl4)、DPPH，美國Sigma公司；紫花前胡素，上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉移酶試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒、抑制與產生超氧陰離子自由基測定試劑盒、羥自由基測試試劑盒，南京建成生物技術有限公司；過硫酸鉀分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

清潔級雄性ICR小鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SYXK(粵)2016-0167，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2015-0147，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2013-0008。

1.2 實驗動物分組、模型建立與給藥方法

將50只健康雄性ICR小鼠 (20±2 g) 每組10只隨機分組，正常對照組，CCl4肝損傷模型組，紫花前胡素低、中、高劑量組 (50,100,200 mg/kg)。給藥組分別按各劑量紫花前胡素進行灌胃，正常組、模型組按等體積生理鹽水灌胃，共30 d，隔天給藥。末次給藥1 h后，正常組腹腔注射等體積玉米油，模型組和紫花前胡素給藥組腹腔注射10 mL/kg CCl4，禁食不禁水繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。各組小鼠眼眶靜脈叢取血，離心取血清于4 ℃保存?zhèn)溆?。采血后處死小鼠，迅速取肝組織，用冷生理鹽水洗滌干凈，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清學指標檢測

按照試劑盒操作說明書，采用酶標儀檢測各組小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性。

1.4 肝臟組織細胞色素酶CYP2E1檢測

取等量肝臟組織，剪碎后于勻漿器將肝臟組織勻漿，將勻漿液于4℃超速離心，取上清液。按照試劑盒操作說明書，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠肝組織CYP2E1水平。

1.5 紫花前胡素清除超氧陰離子能力的檢測

以維生素E為陽性對照，按照試劑盒操作說明書，利用酶標儀，于波長550nm處比色，檢測紫花前胡素清除超氧陰離子能力。

1.6 紫花前胡素清除羥自由基能力的檢測

以維生素E為陽性對照，按照試劑盒操作說明書，利用可見分光光度計，于波長550nm處比色，檢測紫花前胡素清除羥自由基能力。

1.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)結果用x±s表示，利用Prism 5軟件，one-way ANOVA檢驗，以p<0.05為顯著性差異，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 紫花前胡素對CCl4誘導急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響

表1 紫花前胡素對CCl4誘導急性 肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

如表1所示，在采用腹腔注射CCl4后，與正常組小鼠對比，模型組小鼠血清ALT和AST的活力顯著升高，表明造模成功。與模型組小鼠相比，紫花前胡素給藥組能夠顯著降低ALT和AST的活力，且呈濃度依賴性，表明小鼠提前給予紫花前胡素能夠對CCl4誘導的急性肝損傷起到一定的緩解作用。

2.2 紫花前胡素對CCl4誘導急性肝損傷小鼠肝組織細胞色素酶CYP2E1的影響

圖1結果顯示，在采用腹腔注射CCl4后，與正常組小鼠對比，模型組小鼠CYP2E1的含量顯著升高，而提前給予低、中、高濃度紫花前胡素灌胃給藥后，與模型組比較，CYP2E1的含量顯著降低 (P < 0.05)，提示紫花前胡素可能通過調節(jié)機體CYP2E1的含量來抵御CCl4誘導的肝損傷。

圖1 紫花前胡素對CCl4誘導 急性肝損傷小鼠肝組織CYP2E1的影響

2.3 紫花前胡素在體外對超氧陰離子及羥自由基的清除能力

紫花前胡素在體外，超氧陰離子及羥自由基的清除能力隨濃度增加呈上升趨勢，且與維生素E陽性對照組的增強幅度相似，但其自由基清除效果不如同等濃度的維生素E陽性對照組。

圖2 紫花前胡素在體外對超氧陰離子及羥自由基的清除能力

3 討論

本研究利用CCl4誘導小鼠建立急性肝損傷模型，觀察紫花前胡素對其保護作用及可能的機制。CCl4在肝細胞內，經(jīng)細胞色素酶CYP450作用，能夠生成三氯甲基(CCl3·)等自由基，而生成的自由基可以攻擊細胞膜脂質雙分子層[4]，進而改變細胞膜的通透性，肝細胞內大量酶釋放到血液中，包括ALT及AST。因此，通過檢測血清中的ALT和AST的含量能夠判斷肝臟受損傷程度[5]。本研究結果表明，提前給予紫花前胡素對小鼠進行灌胃，可以有效抑制CCl4引起的血清ALT及AST的升高，提示紫花前胡素對CCl4導致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。而在進一步檢測中，我們發(fā)現(xiàn)各濃度紫花前胡素處理組能夠有效抑制細胞色素酶CYP2E1的產生，提示紫花前胡素可能減少CCl3·等自由基的產生，進而實現(xiàn)其對肝損傷的保護作用。

此外，我們觀察了紫花前胡素在體外對自由基的清除能力。超氧陰離子和羥自由基均具有極強的氧化能力，能夠攻擊機體造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸及脂類等生物大分子，進而導致細胞死亡[6]。我們的結果表明，在體外，紫花前胡素能夠有效的清除超氧陰離子及羥自由基，具有較強的抗氧化活性。因此，我們推測紫花前胡素能夠抗氧化進而實現(xiàn)對肝損傷的保護作用。

4 結論

研究結果表明，紫花前胡素對CCl4導致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用，推測可能是通過抑制細胞色素酶CYP2E1的產生進而減少三氯甲基等自由基的產生實現(xiàn)的。此外，紫花前胡素自身的清除自由基的能力也能夠較好的預防和改善肝損傷。但紫花前胡素是如何抑制CYP2E1產生的需要進一步的研究。本研究為紫花前胡素在臨床治療肝損傷提供了初步的實驗依據(jù)。