王超楠，張 斌，張 紅，溫娟娟，王 濤

(1.天津科潤蔬菜研究所,蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387)

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)是十字花科蕓薹屬中的常見蔬菜，種植和分布面積廣，是我國菜籃子中的重要蔬菜。近年來，由于蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron.)的侵染，大白菜根腫病頻發(fā)，且在世界范圍內(nèi)的危害面積日益擴(kuò)大，導(dǎo)致大白菜的品質(zhì)和產(chǎn)量受到了極大影響，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致絕收，該病現(xiàn)已成為大白菜育種過程中亟須解決的問題[1]。由于根腫菌在土壤中的存活時間長，攜帶休眠孢子的土壤很容易導(dǎo)致病害的持續(xù)發(fā)生[2]，而且利用農(nóng)業(yè)、化學(xué)和生物等防治手段不能從根本上解決根腫病的防治問題，所以，培育抗根腫病的大白菜新品種是防治該病的最佳方法。

傳統(tǒng)育種方法周期長，選擇準(zhǔn)確性差，極易受到外界環(huán)境的影響，造成病菌的傳播。而利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對抗病性進(jìn)行選擇，不受植株生長發(fā)育時期和環(huán)境條件的限制，降低了誤選目的基因的可能性，顯著提高了目標(biāo)性狀選擇的準(zhǔn)確性和抗病育種工作的效率[3-7]。因此，本研究對抗根腫病基因進(jìn)行初定位，篩選與抗根腫病基因連鎖的分子標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔助選擇培育抗根腫病大白菜新品種提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：感病親本為津白56的高代自交系G4，抗病親本為藥膳春的高代自交系G6，G4和G6雜交獲得的F1，F(xiàn)1自交構(gòu)建的F2分離群體。所有試材均由天津科潤蔬菜研究所大白菜課題組提供。

人工接種所用根腫病菌株采自湖北省恩施市火燒坪鄉(xiāng)的大白菜根腫病發(fā)病腫根。

供試分子標(biāo)記引物：共計(jì)680個，包括文獻(xiàn)中已發(fā)表的與大白菜抗根腫病基因連鎖的引物標(biāo)記29個[8]，王艷[9]構(gòu)建的大白菜遺傳圖譜中的415個InDel和92個SSR標(biāo)記引物，大白菜基因組數(shù)據(jù)庫Brassica Database(http：//brassicadb.org)中的144個SSR標(biāo)記引物。以上引物均由華大基因合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工接種根腫菌與育苗培養(yǎng) 采用菌土法[10]進(jìn)行人工接種，將帶有根腫菌的腫根放入組織攪拌機(jī)內(nèi)，再加入適量蒸餾水打成勻漿制成孢子懸浮液，然后和滅菌土混合，使菌土孢子含量達(dá)到108個/g[11-12]，pH值調(diào)至6.5左右，含水量控制在60%[13]。

2016年3月，所有供試材料均播種于天津科潤蔬菜研究所的溫室內(nèi)?？?、感親本及F1各播種25株，F(xiàn)2群體播種500株。播種后苗盤置于溫室通風(fēng)陰涼處，溫度控制在20～25 ℃，避免陽光長時間直曬，苗盤下保持1 cm水層，正常管理。

1.2.2 根腫病抗性鑒定與病情調(diào)查 2016年4月，在接菌培養(yǎng)30 d后，對親本、F1和F2群體進(jìn)行人工接種的抗病性鑒定。將每個單株從育苗盤里取出，用清水洗凈根部后觀察記錄發(fā)病情況，并采集以上所有單株新鮮葉片2～3片，編號放入對應(yīng)的自封袋中，-80 ℃保存，用于基因組DNA的提取。

大白菜苗期根腫病病情調(diào)查方法和分級標(biāo)準(zhǔn)參考王彤彤[14]和Piao等[15]的描述，按照0～7級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查單株發(fā)病情況(圖1)，0，1 級記為抗病，3，5，7級記為感病。根據(jù)以上鑒定結(jié)果，對其分離情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析供試大白菜材料根腫病抗性遺傳規(guī)律。

圖1 人工接種抗性鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Artificial inoculation identification classification standard

1.2.3 大白菜基因組DNA提取和質(zhì)量檢測 使用CTAB法[16]提取親本、F1和F2大白菜植株葉片的基因組DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳(電泳緩沖液為1×TAE)檢測提取大白菜基因組DNA的質(zhì)量，最后用蒸餾水將DNA原液稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應(yīng)體系與抗根腫病基因連鎖標(biāo)記的篩選 本試驗(yàn)采用10 μL的PCR反應(yīng)體系：基因組DNA(50 ng/μL)1 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Mix(10 μg/mL) 5 μL，ddH2O 3.2 μL，總體積10 μL。

取基因組DNA樣品1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，快速銀染法染色檢測、照膠保存，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶。

1.2.5 遺傳圖譜的構(gòu)建與抗病基因的定位 整理統(tǒng)計(jì)所有分子標(biāo)記在親本、F1和F2單株中的擴(kuò)增條帶類型，篩選出連鎖標(biāo)記。根據(jù)單株抗病性表型和單株分子標(biāo)記的基因型鑒定結(jié)果，利用JoinMap 4.0軟件分析目的基因和分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系，進(jìn)行基因定位，設(shè)置LOD值為3.0，構(gòu)建連鎖圖譜。

1.2.6 新定位抗根腫基因位點(diǎn)與Crr1的對比 由于新定位抗根腫基因位點(diǎn)與Crr1均位于A08染色體上，為驗(yàn)證二者是否為同一位點(diǎn)，同時在已有研究基礎(chǔ)上，開發(fā)Crr1基因的多態(tài)性分子標(biāo)記，筆者根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中Crr1基因的定位區(qū)間，對供試大白菜抗、感親本材料Crr1基因定位區(qū)間內(nèi)序列進(jìn)行測序，比對測序結(jié)果(圖2)，同時結(jié)合大白菜數(shù)據(jù)庫(http：//brassicadb.org/brad/)基因組信息，在序列差異區(qū)域使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了6對新的InDel分子標(biāo)記(表1)，并在F2群體中進(jìn)行驗(yàn)證，繪制連鎖圖譜，篩選新的多態(tài)性標(biāo)記，并分析新標(biāo)記與新定位位點(diǎn)間的位置關(guān)系。

圖2 抗、感親本材料定位區(qū)域部分序列比對結(jié)果Fig.2 Resistance and susceptible parental material localization region partial sequence alignment result

引物名稱 Primer name上游引物序列Upstream primer base sequence下游引物序列Downstream primer base sequenceBrID10378TGTGGGAAGGAAATAAAGTAAGTACATCCATCCACTTGAGATTTCTAATCBrID10379GAGCTCCTAATGGAAATAAAAATGACATTAAGAAAAAGACGATCCTCAGCBrID10380CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGGCTTGAGATTGGTCATATTTCCAATABrID10381TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAAGGATGTTCAAGTCTTATGGAGCTTCBrID10382ACTTGTAATCAATGGATGCACAAAGAACTTTGTCCTGTAAAAAGAGCABrID10383CGATTCAGTTTGAGGCAGTTAACAAACTTGTAATCAATGGATGCACAAAG

2 結(jié)果與分析

2.1 根腫病抗性鑒定結(jié)果和遺傳學(xué)分析

圖3 感病、抗病親本及F1抗病性鑒定結(jié)果Fig.3 The parents，F(xiàn)1 generation of disease resistance identification result

圖4 F2群體部分單株抗病性鑒定結(jié)果Fig.4 Part of the plants in F2 populations result

2.2 分子標(biāo)記篩選與抗根腫病基因定位

本研究先利用抗、感親本和F1對文獻(xiàn)中已經(jīng)發(fā)表的與大白菜抗根腫病基因緊密連鎖的29對分子標(biāo)記，王艷[9]報(bào)道的均勻分布在大白菜10條染色體上的415對InDel標(biāo)記和92對SSR標(biāo)記，以及大白菜基因組數(shù)據(jù)庫中的144對SSR引物標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到分布在10條染色體上的83對存在多態(tài)性的分子標(biāo)記(圖5)。

在F2群體中挑選24株極抗和24株極感單株組成48株極端表型群體，將83對多態(tài)性標(biāo)記在48株極端表型群體中進(jìn)行驗(yàn)證，對得到的連鎖標(biāo)記再進(jìn)一步擴(kuò)大F2群體進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果得到2個與抗病基因連鎖的InDel分子標(biāo)記(圖6)，分別為BrID10727和BrID10427，這2個分子標(biāo)記都位于A08染色體上，初步判定試驗(yàn)材料所含抗根腫病基因位于大白菜A08染色體上。

查閱文獻(xiàn)，尋找A08染色體上與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記，經(jīng)過在雙親和F1間進(jìn)行多態(tài)性篩選和在F2群體中的進(jìn)一步驗(yàn)證，又得到了3個與抗根腫基因連鎖的InDel標(biāo)記，分別為BrID10867、BrID11507和BrID11233，利用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜(圖7)。

箭頭所指為多態(tài)性分子標(biāo)記的引物擴(kuò)增條帶。The arrow indicates the polymorphism marker amplified bands.

圖6 多態(tài)性分子標(biāo)記BrID10427在48株極端表型群體間的檢測結(jié)果Fig.6 Polymorphism markers BrID10427 between 48 extreme phenotypic groups test result

圖7 多態(tài)性分子標(biāo)記在遺傳圖譜和物理圖譜中的位置Fig.7 The location of polymorphic molecular markers in genetic maps and physical maps

結(jié)果顯示，抗病基因被定位在BrID10727-BrID10867，與抗病基因的遺傳距離分別為4.6，2.5 cM，通過將這2個標(biāo)記的上下游引物序列與大白菜基因組序列信息進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，這2個分子標(biāo)記之間的物理區(qū)間為0.43～6.48 Mb。其余3個分子標(biāo)記BrID11233、BrID10427和BrID11507與CR基因的遺傳距離分別為3.1，5.8，8.1 cM，且都和BrID10867位于一側(cè)。

2.3 新定位抗根腫基因位點(diǎn)與Crr1的對比

重復(fù)2.2中的步驟，將基于Crr1基因序列新設(shè)計(jì)的6個InDel標(biāo)記在F2群體中進(jìn)行篩選驗(yàn)證，獲得1個與抗病基因連鎖的多態(tài)性分子標(biāo)記，即BrID10381(圖8)。利用JoinMap 4.0分析數(shù)據(jù)并繪制遺傳連鎖圖譜(圖9)。結(jié)果顯示，基于Crr1基因序列開發(fā)的InDel標(biāo)記BrID10381與新定位抗根腫病基因位點(diǎn)的遺傳距離為6.5 cM，該標(biāo)記在物理圖中的位置為11.61 Mb，在新定位抗根腫基因初定位區(qū)間的外側(cè)，因此，可以推斷新定位抗根腫基因位點(diǎn)與Crr1并非同一位點(diǎn)。

圖8 新設(shè)計(jì)標(biāo)記BrID10381在48株極端表型群體間的檢測結(jié)果Fig.8 New design marker BrID10381 between 48 extreme phenotypic groups test result

圖9 標(biāo)記BrID10381在遺傳圖譜和物理圖譜中的位置Fig.9 The location of BrID10381 in genetic maps and physical maps

3 結(jié)論與討論

本研究采用人工接種鑒定的方法對供試抗、感親本材料、F1和F2群體進(jìn)行了根腫病抗性鑒定，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)材料中的根腫病抗性受顯性單基因控制，與前人研究結(jié)果一致，Suwabe等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大多用于研究的大白菜抗病材料中，根腫病抗性均是受單個顯性主效基因控制，只有G004這一抗病材料中根腫病抗性是數(shù)量遺傳，受多基因控制。

本研究將抗根腫病基因初步定位在了大白菜A08染色體上6.05 Mb范圍內(nèi)，2個側(cè)翼分子標(biāo)記的物理位置分別為0.43，6.48 Mb。已報(bào)道的8個抗根腫病基因分別被定位在5條染色體上，其中位于A08上的基因有一個，為Crr1[18-23]。雖然本研究中的抗根腫病基因與Crr1同樣位于A08上，但與Crr1緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記BRMS-088[24-25]在本研究供試群體中驗(yàn)證后不具有多態(tài)性，且經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，基于Crr1基因序列新開發(fā)的標(biāo)記BrID10381在物理圖中的位置為11.61 Mb，不在新定位抗根腫基因初定位區(qū)間內(nèi)，因此，可以推斷新定位抗根腫基因位點(diǎn)與Crr1并非同一位點(diǎn)，同時基于Crr1基因序列新開發(fā)的標(biāo)記BrID10381具有多態(tài)性，與BRMS-088相比可以用于Crr1基因的分子標(biāo)記輔助選擇，在大白菜抗根腫病育種實(shí)踐中具有很大的應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果為下一步該抗病基因的精細(xì)定位和基因克隆以及分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種奠定了基礎(chǔ)，有助于未來大白菜抗根腫病新品種的選育。