童文艷，胡孟可，徐林娜，喬慧聰，李 芬

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

NtTkr是新發(fā)現(xiàn)的煙草驅(qū)動蛋白超家族新成員，屬于組織特異性基因，僅在分裂旺盛組織優(yōu)勢表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控，與胚、種子大小和萌發(fā)有關(guān)[1-3]。驅(qū)動蛋白種類繁多[4-6]，功能多樣，不僅與細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞分裂、形態(tài)建成、胞內(nèi)物質(zhì)定向運(yùn)輸?shù)缺姸嗌镞^程相關(guān)，對大腦發(fā)育、記憶提升、神經(jīng)元活性也很重要[7-8]，是維持細(xì)胞活性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，這些功能均與其尾部卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(Coiled-coil，CC)密切相關(guān)。

NtTkr尾部共有3個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(CC1、CC2、CC3)，其中CC1、CC2 參與莖稈結(jié)構(gòu)的形成，CC3(1049-1143 Aa)負(fù)責(zé)與底物的結(jié)合[2]。酵母雙雜交分析表明，CC3的T1084突變或缺失會影響NtTkr與靶蛋白的結(jié)合強(qiáng)度。為確定T1084缺失或替換突變對NtTkr與候選蛋白體外互作的影響，采用重疊延伸PCR在煙草NtTkr尾部引入T1084缺失和替換點(diǎn)突變，并將突變的NtTkr尾部克隆入pMXB10質(zhì)粒，構(gòu)建重組載體pMXB10-T1084d和pMXB10-T1084A，最后將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，IPTG成功誘導(dǎo)NtTkr-T1084A-1320和NtTkr-T1084d-1317表達(dá)，為確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及藥品

材料：菌株AH109、Y187，質(zhì)粒pBI121-NtTkr、pUC19、pMXB10，大腸桿菌DH5α、BL21、DE3等。

主要試劑及藥品：SD及缺陷培養(yǎng)基、2×SDS上樣緩沖液、X-Gal(Clontech公司，美國)；KOD-plus高保真酶(TIANGEN，北京)；dNTPs(2 mmol/L each)、10×KOD-plus Buffer、25 mmol/L MgSO4(ToYoBo)；DNA Marker λ-Eco T14(TIANGEN，北京)；6×Loading Buffer、限制性內(nèi)切酶、T4-DNA連接酶(TaKaRa，日本)；質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN，北京)；DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa，日本)；鮭魚精DNA(上海浩然生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的擴(kuò)增與檢測 缺失和替換突變采用3對引物的3輪PCR來完成，引物由TaKaRa生物公司合成。目的基因擴(kuò)增引物序列為：P1：5′-CATATGGATGGTCCCTGTGGAAGG-3′，P2：5′-GCGGCCGCTATGCGTTCCTGGTAAATGGC-3′，在P1和P2兩端分別引入NotⅠ和NdeⅠ酶切位點(diǎn)；替換突變(T1084A)位點(diǎn)的中間互補(bǔ)引物序列為P3′：5′-CTCAACTTAAAGACGCTGCTGAAGCTGTTC-3′，P4：5′-GAACAGCTTCAGCAGCGTCTTTAAGTTGAG-3′；缺失突變(T1084d)位點(diǎn)的中間互補(bǔ)引物序列為P5：5′-CTCAACTTAAAGACGCTGAAGCTGTTC-3′，P6：5′-GAACAGCTTCAGCGTCTTTAAGTTGAG-3′。以質(zhì)粒 pBI121-NtTkr為模板，分別以P1、P3，P2、P4及P1、P5，P2、P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后等摩爾混合，取適量作為模板，以P1、P2為引物擴(kuò)增完整尾部片段。

1.2.2 表達(dá)載體pMXB10-T1084A和pMXB10-T1084d的構(gòu)建和鑒定 凝膠電泳回收SmaⅠ線性化的pUC19和PCR產(chǎn)物，取適量回收產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下16 ℃連接16 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α細(xì)胞，涂AMP+和X-gal選擇平板，經(jīng)NotⅠ-NdeⅠ雙酶切鑒定獲得正確重組子，并進(jìn)行基因組測序。將pMXB10與測序正確的pUC19-T1084d、pUC19-T1084A分別進(jìn)行NotⅠ-NdeⅠ雙酶切，回收6.68 kb的pMXB10載體片段和約1.32 kb的突變目的片段，在T4DNA連接酶作用下16 ℃連接16 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌超級感受態(tài)細(xì)胞BL21，NotⅠ-NdeⅠ雙酶切鑒定。

1.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測 將鑒定后的pMXB10-T1084A和pMXB10-T1084d載體轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)超級感受態(tài)細(xì)胞，在50 mg/mL氨芐青霉素LB平板上挑取單克隆，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)，次日以1∶100稀釋菌液，培養(yǎng)4 h左右至OD600為0.6～0.8，分別經(jīng)0，0.04，0.06，0.10，0.20 mmol/L和0，0.05，0.10，0.50 mmol/L的IPTG于37 ℃誘導(dǎo)4 h后，取菌液2 mL，于4 ℃、1 000 r/min離心1 min，棄上清。在得到的菌體沉淀中加入還原型2×SDS上樣緩沖液和去離子水各100 μL，混勻后煮沸10 min，取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 T1084d和T1084A突變尾部的獲得及克隆入pUC19的鑒定結(jié)果

以pBI121-NtTkr為模板PCR擴(kuò)增1 kb和350 bp的T1084上、下游片段(圖1-A)及以兩片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的T1084d、T1084A片段(圖1-B)，結(jié)果與預(yù)期長度相符。將T1084d、T1084A克隆入SmaⅠ線性化的pUC19，經(jīng)藍(lán)白斑試驗篩選獲得重組子后進(jìn)行SmaⅠ-BamHⅠ雙酶切鑒定，得到約1.32 kb的插入片段(圖1-C)，與突變尾部1 317，1 320 bp編碼區(qū)符合。測序結(jié)果顯示，編碼第1 084 位蘇氨酸已經(jīng)缺失或為丙氨酸替代。

A.缺失和替換突變短片段PCR產(chǎn)物：1,2.克隆得到的T1084d和T1084A 的350 bp短片段；3.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量λEcoT14；4，5.克隆T1084d和T1084A的1 kb長片段。B.缺失和替換突變完整片段PCR產(chǎn)物：1，2.1.32 kb的T1084d和T1084A片段；3.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量λEcoT14。C.缺失和替換突變尾部克隆入pUC19后的酶切鑒定：1，2.NotⅠ-NdeⅠ雙酶切后的pUC19載體和約1.32 kb的T1084d和T1084A片段；3.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量λEcoT14。

A.Short fragment PCR products of deletion and replacement mutant:1，2.The cloned 350 bp short fragment of T1084dand T1084A; 3.DNA standard molecular mass λEcoT14; 4，5.The cloned 1 kb long segments of T1084dand T1084A.B.Complete fragment PCR products of deletion and replacement mutant:1，2.1.32 kb fragment of T1084dand T1084A; 3.DNA standard molecular mass λEcoT14.C.Restriction analysis of the deleted and replaced mutant tail cloned into pUC19:1，2.pUC19 vector after theNotⅠ-NdeⅠ double enzymed and about 1.32 kb T1084dand T1084A fragments; 3.DNA standard molecular mass λEcoT14.

圖1 T1084d和T1084A的獲得及克隆入pUC19后的鑒定結(jié)果
Fig.1 Acquisitin of T1084dand T1084A and identification results after cloning into pUC19

2.2 pMXB10-T1084A和pMXB10-T1084d的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

將測序正確的重組載體pUC19-T1084d、pUC19-T1084A均與質(zhì)粒pMXB10進(jìn)行NotⅠ-NdeⅠ雙酶切，分別回收約1.32 kb的目的片段和6.68 kb的載體片段并進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α并篩選得到重組子，再進(jìn)行NotⅠ-NdeⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示得到了預(yù)期片段(圖2)，表明獲得了所需的T1084d、T1084A與pMXB10誘餌表達(dá)質(zhì)粒。

A.原核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定：1. DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量λEcoT14；2，3.NotⅠ-NdeⅠ雙酶切后6.68 kb的pMXB10載體和1.32 kb的T1084d和T1084A片段。B.pMXB10-NtTkr-T1084d-1317/1084A-1320圖譜，顯示大小約1.32 kb的突變尾部插入pMXB10的酶切位點(diǎn)。

A.Enzymed digestion and identification of prokaryotic expression plasmid:1.DNA standard molecular mass λEcoT14 ; 2，3. 6.68 kb pMXB10 vector ofNotⅠ-NdeⅠ doubled enzyme digestion and 1.32 kb T1084dand T1084A fragment.B.pMXB10-NtTkr-T1084d-1317/1084A-1320 map，showing that the mutant tail of about 1.32 kb was inserted into the enzyme digestion site of pMXB10.

圖2 原核表達(dá)質(zhì)粒pMXB10-T1084d、pMXB10-T1084A的酶切鑒定結(jié)果
Fig.2 Enzyme digestion identification of prokaryotic expression plasmid pMXB10-T1084dand pMXB10-T1084A

2.3 NtTkr-T1084A-1320和NtTkr-T1084d-1317的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組載體pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T1084d分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，設(shè)置IPTG濃度梯度、220 r/min、37 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌體，稀釋煮沸后用12% SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況(圖3)。由圖3-A可知，IPTG濃度大于0.06 mmol/L時，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)量差異不大，均可高效表達(dá)約77 ku的NtTkr-T1084A-1320蛋白質(zhì)；由圖3-B可知，IPTG濃度大于0.05 mmol/L，誘導(dǎo)后目的蛋白的表達(dá)量幾乎相當(dāng)，均可高效表達(dá)約76.2 ku的NtTkr-T1084d-1317蛋白質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

NtTkr是一個在幼葉和發(fā)育各時期胚等分裂旺盛組織中優(yōu)勢表達(dá)的驅(qū)動家族的新成員[1-3]。具有組織特異性NtTkr可能通過與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用參與基質(zhì)中合成蛋白的定向運(yùn)輸、加工修飾、特定蛋白質(zhì)的降解以及重金屬毒害的解除等諸多生物學(xué)過程，而這些功能都與分子內(nèi)或分子間的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)有著直接關(guān)系[9-10]。已知NtTkr有3個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，而且位于尾部的CC3(1 049-1 143 Aa)很有可能在與靶蛋白的相互作用中發(fā)揮功能。研究已經(jīng)證實(shí)，CC3結(jié)構(gòu)域中1 084位蘇氨酸的缺失和替換，轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞其定位會發(fā)生變化，酵母雙雜交也證實(shí)上述突變會改變與候選蛋白互作的強(qiáng)度[11-12]，但目前對其與底物互作的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域還缺乏認(rèn)識，進(jìn)一步運(yùn)用Pull Down等手段驗證其與候選蛋白的互作非常必要[13-15]，而pMXB10-T1084d和pMXB10-T1084A成功構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)為運(yùn)用Pull Down確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作以及關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域奠定了基礎(chǔ)。

IMPACT系統(tǒng)是一種應(yīng)用廣泛的新型蛋白質(zhì)融合表達(dá)及純化系統(tǒng)，能應(yīng)用到蛋白質(zhì)工程的許多重要領(lǐng)域，可高效誘導(dǎo)且方便后期純化獲得較高純度的目的蛋白[16-18]。故本研究按照經(jīng)濟(jì)實(shí)用的原則，采用了該系統(tǒng)pMXB10質(zhì)粒，通過重疊延伸PCR在煙草NtTkr尾部引入T1084缺失(T1084d)和替換(T1084A)點(diǎn)突變，并將其分別克隆入pMXB10質(zhì)粒，測序及酶切驗證表明，成功構(gòu)建了將T1084A-1320和T1084d-1317克隆入pMXB10的融合表達(dá)載體。

A.NtTkr-T1084A-1320的誘導(dǎo)表達(dá)：1.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker；2-6.濃度依次為0，0.04，0.06，0.10，0.20 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后NtTkr-T1084A-1320蛋白的表達(dá)。B.NtTkr-T1084d-1317的誘導(dǎo)表達(dá):1-4.濃度依次為0.50，0.10，0.05，0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后NtTkr-T1084d-1317蛋白的表達(dá)；5.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker。

A.Induced expression of NtTkr-T1084A-1320:1.Protein molecular mass Marker; 2-6.Expression of NtTkr-T1084A-1320 protein induced by IPTG at concentrations of 0，0.04，0.06，0.10，0.20 mmol/L.B.Induced expression of NtTkr-T1084d-1317:1-4.Protein expression of NtTkr-T1084d-1317 induced by IPTG at concentrations of 0.50，0.10，0.05，0 mmol/L; 5.Protein molecular mass Marker.

圖3 NtTkr-T1084A和NtTkr-T1084d的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果
Fig.3 Induced expression of NtTkr-T1084A and NtTkr-T1084d

成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體后，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)超級感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。目的蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和表達(dá)量因蛋白質(zhì)而異，因此誘導(dǎo)表達(dá)的時間和溫度可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。為了使蛋白質(zhì)達(dá)到比較大的表達(dá)量，研究中嘗試摸索了最佳的培養(yǎng)條件。如，對于T1084A的誘導(dǎo)，設(shè)置了5個不同濃度梯度的IPTG，蛋白質(zhì)電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPTG濃度為0.06 mmol/L時的表達(dá)量明顯大于0.04 mmol/L時，但卻與0.1，0.2 mmol/L時相差不大，表明IPTG濃度為0.06 mmol/L較為適宜。在誘導(dǎo)溫度的選擇上，在相同條件下，嘗試了37 ℃誘導(dǎo)4 h、30 ℃誘導(dǎo)6 h、22 ℃誘導(dǎo)過夜。結(jié)果顯示，37 ℃誘導(dǎo)4 h蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對較大。經(jīng)過上述摸索，選擇的最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為：220 r/min、0.06 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)4 h，目的蛋白NtTkr-T1084A-1320得到了高效表達(dá)。運(yùn)用類似的方法發(fā)現(xiàn)，220 r/min、0.05 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)4 h，可以實(shí)現(xiàn)NtTkr-T1084d-1317 的高效表達(dá)。

綜上，成功構(gòu)建了NtTkr-T1084A-1320和NtTkr-T1084d-1317克隆入pMXB10的融合表達(dá)載體并誘導(dǎo)其高效表達(dá)，上述兩突變蛋白質(zhì)的成功表達(dá)為下一步的蛋白質(zhì)純化、Pull Down確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作進(jìn)而確定NtTkr與蛋白質(zhì)互作的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域奠定了基礎(chǔ)。