史 麗，吳亞茹，王曉娟，常燕楠，龐鵬湘，郜 剛

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000)

植物的生長(zhǎng)發(fā)育常常受到干旱、鹽度等非生物脅迫的影響[1]。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的表達(dá)，是植物適應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵因子[2]。NF-Y轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)差異表達(dá)、選擇性剪接、細(xì)胞氧化還原電位等相互作用，來(lái)調(diào)節(jié)其活性[3]。NF-YC含有組蛋白折疊基序(HFMs)，并且通過(guò) HFMs相互作用首尾相接組裝形成異二聚體，再與NF-YA相互作用形成NF-Y轉(zhuǎn)錄因子。在DNA和NF-Y轉(zhuǎn)錄的結(jié)合中都發(fā)揮重要的作用[4]。NF-YC蛋白的保守域中含有1個(gè)與H2A蛋白結(jié)構(gòu)類似的HFM結(jié)構(gòu)域，在蛋白-蛋白和蛋白-DNA的互作中發(fā)揮重要作用。

NF-Y被稱為血紅素激活蛋白(HAP)或CCAAT結(jié)合因子(CBF)，是所有真核生物中存在的三聚體轉(zhuǎn)錄因子[5]。在植物中，其生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在開(kāi)花進(jìn)程、胚胎發(fā)育、葉綠體發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等多方面的調(diào)控[6]。已證實(shí)，番茄NF-Y因子在調(diào)節(jié)果實(shí)成熟中起重要作用，不同的NF-Y因子在番茄果實(shí)成熟過(guò)程中的作用可能不同[7]。另外，有研究表明，NF-Y基因過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)小麥的耐旱性[8]。1995年，Albani等[9]從擬南芥中分離出了第1個(gè)NF-YC家族成員AtNF-YC2。AtNF-YC2亞基的過(guò)表達(dá)加速了植物的開(kāi)花過(guò)程并提高了植物的轉(zhuǎn)錄水平[10]。1998年Edwards等[11]首次鑒定出擬南芥中有13個(gè)NF-YC亞基。此外，E Z等[12]研究表明，NF-Y可能在單子葉植物中分化以調(diào)節(jié)胚乳發(fā)育。NF-YC亞基的過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)水稻植株的抗鹽性。Chen等[13]研究表明，NO、H2O2和ABA參與鹽脅迫誘導(dǎo)的NF-YC基因的表達(dá)，當(dāng)沒(méi)有H2O2、NO分子或者ABA合成受阻時(shí)，NF-YC基因的表達(dá)終止。2006年，Ben-Naim等[14]研究表明，CCT存在于多數(shù)開(kāi)花相關(guān)蛋白中，擬南芥中的NF-YC與CCT保守域互作，從而調(diào)控植株開(kāi)花時(shí)間，番茄中的NF-YC也參與開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)。AtNF-YC與AtNF-YB結(jié)合成二聚體，參與到光周期開(kāi)花途徑中[15]。云杉中的NF-YC亞基過(guò)表達(dá)時(shí)促進(jìn)花粉管的發(fā)育[16-17]。此外，NF-YC參與小麥中有關(guān)光合作用相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控；在水稻中，NF-Y轉(zhuǎn)錄因子喪失功能后，葉綠體退化，降低了葉綠素含量[18]。

本研究從山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室前期的試驗(yàn)中獲得1條馬鈴薯EST序列[19]，使用電子克隆方法獲得馬鈴薯NF-YC基因的全長(zhǎng)cDNA，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。關(guān)于馬鈴薯青枯菌植病互作產(chǎn)生的NF-YC基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，分離和鑒定馬鈴薯與青枯菌互作誘導(dǎo)產(chǎn)生的NF-YC基因，通過(guò)相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)其生物學(xué)功能和作用機(jī)制的預(yù)測(cè)和研究，旨在為后期的基因功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料選用的是青枯菌高抗基因型ED13，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，青枯菌選用的是菌株P(guān)O41、生理小種3號(hào)(race3)、生化變種2號(hào)(biovar2)。取九葉期至十葉期試管苗，參照He等[20]傷根灌菌接種法接種青枯菌。

1.2 試驗(yàn)方法及電子克隆

山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)中得到1條馬鈴薯EST序列，長(zhǎng)度為796 bp，通過(guò)NCBI BlastN同源比對(duì)檢索，以馬鈴薯NFYC-1-Like(XM_015310514.1)為參考序列，運(yùn)用電子克隆方法進(jìn)行比對(duì)、拼接，直到序列能完整翻譯，進(jìn)而獲得NF-YC全長(zhǎng)序列。將其與馬鈴薯全基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中可用的序列進(jìn)行比對(duì)[21]。

1.3 馬鈴薯NF-YC基因的生物信息學(xué)分析

馬鈴薯NF-YC基因的核酸及氨基酸組成、編碼蛋白的理化性質(zhì)、開(kāi)放閱讀框(Open reading frame)的翻譯與尋找分別采用Bioedit、Prot-Param和ProtScale服務(wù)器及ORF dinder等在線工具完成。親、疏水性、蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析利用在線工具ProtScale、NetPhos 3.1、TargetP 1.1、SignalP 4.1、TMHMM 2.0軟件完成。保守結(jié)構(gòu)域通過(guò)在線工具NCBI中的CDD(Conserved Domain Database)預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)SOPMA和CPH Models 3.2 Server等在線工具完成，三級(jí)結(jié)構(gòu)用 Accelrys DS Visualise軟件顯示結(jié)果。N-J(Neighbor-Joining)法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用MEGA軟件[22]完成(表1)。

表1 生物信息學(xué)分析所用的在線分析工具Tab.1 The online tools used in bioinformatics analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯NF-YC基因cDNA全長(zhǎng)的獲取

在本實(shí)驗(yàn)室前期得到1條馬鈴薯EST序列，以馬鈴薯NFYC-1-Like(XM_015310514.1)為參考序列，在NCBI BlastN中通過(guò)同源比對(duì)，同源性達(dá)到99%。通過(guò)電子克隆方法，經(jīng)過(guò)比對(duì)、拼接，獲得NF-YC全長(zhǎng)cDNA序列，長(zhǎng)度為1 132 bp。通過(guò)與馬鈴薯全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將其命名為StNF-Y。GenBank登錄號(hào)(Accession No.) ：MH 919392.1。

2.2 馬鈴薯StNF-Y理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用ExPasy在線工具中的ProtParam預(yù)測(cè)馬鈴薯StNF-Y蛋白的理化性質(zhì)[23]，結(jié)果如表2所示，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為63.54，大于40，說(shuō)明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；平均疏水性為-0.503，初步判斷該基因?yàn)橛H水性蛋白。由圖1 可知，該蛋白在第100-140個(gè)氨基酸之間出現(xiàn)最大疏水值2.2，在第100-120個(gè)氨基酸之間出現(xiàn)最小親水值-2.833，且峰值分布在0 以下比分布在0以上的多，再次證明該蛋白為親水性蛋白。在馬鈴薯StNF-Y氨基酸組成中，含量最高的為Asn(97個(gè)，占42.17%)，含量最低的為Cys(1個(gè)，占0.43%)。

表2 StNF-Y蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Tab. 2 Predicting primary structure of StNF-Y protein

圖1 StNF-Y蛋白親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity of StNF-Y protein

2.3 馬鈴薯StNF-Y基因全長(zhǎng)cDNA及氨基酸序列分析

利用BioEdit軟件分析，馬鈴薯StNF-Y的全長(zhǎng)cDNA長(zhǎng)度為1 132 bp，終止密碼子為T(mén)AA，編碼230個(gè)氨基酸(圖2)。

2.4 保守域預(yù)測(cè)及氨基酸同源序列比對(duì)分析

使用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved Domain Database，CDD)[24]，分析馬鈴薯StNF-Y蛋白的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示(圖3)，該蛋白含有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，主要屬于BUR6 superfamily家族，該結(jié)構(gòu)域位于第44-141個(gè)氨基酸。提交NF-YC基因的氨基酸序列，BlastP搜索StNF-Y的同源氨基酸序列。DNAMAN軟件用于馬鈴薯StNF-Y蛋白和其他物種NF-YC蛋白的氨基酸序列的多重比對(duì)[25]，利用Blast P對(duì)StNF-Y基因編碼的氨基酸同源性進(jìn)行檢

上排為cDNA 序列，下排為氨基酸序列；ATG 為起始密碼子，*代表終止密碼子；下劃線標(biāo)注的為BUR6 superfamily結(jié)構(gòu)域。

The upper lines are cDNA sequences，the lower lines are amino acid sequences; ATG is the start codon，* is the stop codon; Underlined is the BUR6 superfamily domain.

圖2StNF-YcDNA序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.2StNF-Ygene cDNA sequence anddeduced amino acid sequence

索，馬鈴薯StNF-Y基因編碼的氨基酸與番茄Solanumpennellii(XP_015070179.1)、辣椒Capsicumchinense(PHU23636.1)、馬鈴薯Solanumlycopersicum(NP_001234244.1)、煙草Nicotianaattenuata(XP_019248263.1)中的NF-YC蛋白的氨基酸序列具有較高的相似性，分別為94%，93%，84%，81%。結(jié)果顯示(圖4)，StNF-Y結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度保守。

圖3 StNF-Y蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain prediction of StNF-Y protein

圖4 馬鈴薯StNF-Y蛋白與其他植物 NF-YC蛋白的同源性比對(duì)Fig.4 Homology comparison of potato StNF-Y protein with other plant NF-YC proteins

2.5 蛋白分子磷酸化位點(diǎn)分析

使用NetPhos 3.1 Server對(duì)該氨基酸進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，其共有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Ser磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，分別位于第82，157，190，200，205，214個(gè)氨基酸上；Thr磷酸化位點(diǎn)4個(gè)，分別在第26，101，115，158個(gè)氨基酸上；3個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)位于第24，192，215個(gè)氨基酸上。據(jù)推測(cè)，StNF-Y蛋白的活性與功能可能通過(guò)這些位點(diǎn)的磷酸化反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)。

2.6 蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)使用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列的信號(hào)肽，結(jié)果顯示無(wú)信號(hào)肽段出現(xiàn)。使用TMHMM Server 2.0[26]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示該蛋白是一種膜外蛋白，沒(méi)有跨膜區(qū)。使用TargetP 1.1 Server服務(wù)器[27]分析蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示StNF-Y轉(zhuǎn)錄因子主要位于胞質(zhì)中的概率最大。

2.7 馬鈴薯StNF-Y轉(zhuǎn)錄因子二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在Expasy的SOPMA服務(wù)器[28]中在線預(yù)測(cè)馬鈴薯StNF-Y轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示，105個(gè)氨基酸可形成α-螺旋，占氨基酸總數(shù)的45.65%；13個(gè)氨基酸可形成延伸鏈，占氨基酸總數(shù)的5.65%；104個(gè)氨基酸可形成無(wú)規(guī)則卷曲，占氨基酸總數(shù)的45.22%。8個(gè)氨基酸形成β-轉(zhuǎn)角，占氨基酸總數(shù)的3.48%。

圖5 StNF-Y蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of StNF-Y protein

2.8 馬鈴薯StNF-Y轉(zhuǎn)錄因子三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用CPHmodels 3.2 Server預(yù)測(cè)StNF-Y的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，目前PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未有全長(zhǎng)氨基酸序列匹配的模板，只能構(gòu)建其保守序列的3D模型(圖6)，完整的StNF-Y三級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲形成，在C端是α-螺旋，在N端有一個(gè)較短的伸展肽段(EP)。

圖6 StNF-Y保守序列(48-140)的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 3D structure of the conserved domain (48-140)of the predicted amino acids

2.9 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)NCBI上的BlastP獲得氨基酸序列的同源序列，使用MEGA 4.0軟件，采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(時(shí)間截止到2018年11月15日)，結(jié)果如圖7所示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，馬鈴薯StNF-Y轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸序列與番茄親緣關(guān)系最近，與辣椒親緣關(guān)系次之，與棉花親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖7 基于StNF-Y蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of StNF-Y protein

3 結(jié)論與討論

本研究在山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室前期工作中利用電子克隆技術(shù)拼接，獲得了馬鈴薯StNF-Y基因的全長(zhǎng)序列，并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)特征、功能屬性和表達(dá)性質(zhì)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析，其核苷酸和氨基酸序列都高度保守，核苷酸序列在茄科植物中保守性高達(dá)95%～100%，表明StNF-Y在進(jìn)化上很保守，這可能與其重要功能有關(guān)。馬鈴薯StNF-Y轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)1 132 bp，編碼230個(gè)氨基酸，磷酸化位點(diǎn)有13個(gè)，StNF-Y是親水性氨基酸，無(wú)信號(hào)肽。通過(guò)更進(jìn)一步的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，StNF-Y蛋白含有BUR6保守功能結(jié)構(gòu)域，屬于BUR6 superfamily家族，并且對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能都至關(guān)重要。該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有4種結(jié)構(gòu)形式：α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，這為實(shí)現(xiàn)其功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過(guò)氨基酸多序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草、牽?；ㄖ械暮宿D(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較近，說(shuō)明StNF-Y蛋白在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守。

近年來(lái)，已經(jīng)分離和鑒定了越來(lái)越多的植物NF-Y基因，其中包括擬南芥[29]、大豆[30]、甘藍(lán)型油菜[31]、葡萄[32]、柑橘[33]等。目前，關(guān)于擬南芥中的NF-Y基因研究的較多，其次是番茄、小麥、水稻等。NF-Y由NF-YA、NF-YB和NF-YC亞類TF組成，已被證明參與植物許多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)和對(duì)各種環(huán)境脅迫刺激的反應(yīng)[34]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，NF-YC轉(zhuǎn)錄因子在糖異生過(guò)程和植物胚乳發(fā)育中起重要作用。Zhang等[35]研究結(jié)果表明，NF-Y基因通過(guò)上調(diào)糖異生基因Pck1和G6pc來(lái)控制葡萄糖代謝的生理功能。此外，NF-Y基因也參與植物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)[36]。擬南芥NF-YC3/4/9與ABI 5啟動(dòng)子的CCAAT元件結(jié)合，激活其在種子萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)及整合GA和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[37]。已證實(shí)，NF-Ys參與了植物響應(yīng)干旱反應(yīng)的ABA信號(hào)傳遞[38]。前幾年，有研究表明，NF-Y轉(zhuǎn)錄因子能引起植物對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)，主要是通過(guò)影響葉綠素含量、光合作用、開(kāi)花進(jìn)程等對(duì)植物生理過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。這與本試驗(yàn)所用的原始序列來(lái)源相一致，初步推測(cè)，其可能同以往發(fā)現(xiàn)的其他植物的NF-YC轉(zhuǎn)錄因子一樣參與相關(guān)防御反應(yīng)。

進(jìn)一步確定馬鈴薯StNF-Y蛋白在植株中實(shí)際的功能表達(dá)，還需要具體的分子生物學(xué)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。有必要針對(duì)該基因表達(dá)的精細(xì)細(xì)胞定位和信號(hào)調(diào)控進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究，這對(duì)于解釋早期馬鈴薯與青枯病的植病互作機(jī)制、進(jìn)行馬鈴薯育種乃至為今后青枯病的控制提供新的目標(biāo)具有重要的理論意義。