王燕飛，紅格日其其格，王光霞，2，3，王瑞剛，2，3，李國婧，2，3

(1.內蒙古農業(yè)大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018； 2.內蒙古植物逆境生理與分子生物學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018； 3.內蒙古抗逆植物遺傳資源利用與分子改良科技創(chuàng)新團隊，內蒙古 呼和浩特 010018)

植物在生長和發(fā)育的不同階段，會遇到各種生物及非生物脅迫，例如昆蟲、機械損傷、干旱、冷、熱、鹽等。在脅迫條件下，細胞常常受到不同程度的損傷，然而，植物在漫長的進化過程中產生了多種適應或抵抗這些逆境條件的機制[1-3]，其中，轉錄激活調控是脅迫應答調控機制之一。轉錄因子，例如NAC、MYB、WRKY等調控下游基因轉錄[4-5]。

NAC轉錄因子(Transcription factor，TF)是植物特有的最大轉錄因子家族之一，參與調控植物生命活動的各階段[6]。NAC轉錄因子由3類基因組成：牽牛花中發(fā)現(xiàn)的NAM(No apical meristem)、擬南芥中的ATAF(Arabidopsis transcription activation factor)和CUC(Cup-shaped cotyledon)[7]。NAC轉錄因子家族基因具有保守的NAC結構域，該結構域由大約150個氨基酸構成，位于氨基酸鏈的N末端，高度保守，作為DNA結合結構域；C端相對可變，作為轉錄激活結構域[8]。NAC轉錄因子參與調控植物生長發(fā)育及逆境脅迫應答，在不同物種中，已有許多NAC基因的功能被報道：Mahmood等[9-10]研究表明，ANAC032促進擬南芥衰老的同時，在蔗糖、鹽、氧化等脅迫條件下，也抑制擬南芥花青素的合成；擬南芥ANAC046能促進擬南芥葉綠素降解和葉片衰老[11]；Chen等[12]研究表明，小麥中過表達TaRNAC1基因促進小麥根系生長、增強抗旱性；中間錦雞兒NAC轉錄因子分析表明，過表達CiNAC1和CiNAC4促進擬南芥主根的伸長及側根數目的增加[13]，CiNAC3和CiNAC4提高轉基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性[14]。

本研究以抗干旱、耐貧瘠、耐寒、耐酷熱的豆科錦雞兒屬灌木中間錦雞兒(Caraganaintermedia)為材料，克隆NAC家族基因CiATAF1，利用生物信息學方法對其序列及結構進行分析。經熒光定量PCR檢測了CiATAF1基因的組織表達特異性及其在干旱、鹽、冷、ABA條件下的表達模式，為后續(xù)研究該基因的功能提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料中間錦雞兒采自內蒙古自治區(qū)烏蘭察布市四子王旗；大腸桿菌感受態(tài)、克隆載體pEASY-Blunt Simple購自北京全式金生物技術有限公司；擬南芥野生型(Col-0)、表達載體pCAMBIA1302保存于內蒙古植物逆境生理與分子生物學重點實驗室；限制性內切酶、T4DNA連接酶購自Thermo公司；氯化鈉(分析純)購自天津市風船化學試劑科技有限公司；總RNA試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；熒光定量分析試劑購自Roche公司；所用到引物由Primer Premier 5設計，見表1，并在上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 材料處理

組織表達特異性：從缽子中選取長勢較好的中間錦雞兒3株，蒸餾水去除根部泥土，將根、莖、葉分離，分別在液氮條件下冷凍，保存于-80 ℃冰箱。另取3株中間錦雞兒整株同上條件保存。

干旱處理：中間錦雞兒最后一次澆水3 d后開始取樣，一直持續(xù)停止?jié)菜扛? d取一次樣品，每次樣品取3株。干旱12 d后開始復水，復水3 d后最后一次取樣。取樣時間為0，3，6，9，12 d和復水3 d。

NaCl處理：中間錦雞兒最后一次澆水3 d后，取對照0 h樣品，立即澆3 L的200 mmol/L NaCl，取樣時間點為0，0.5，1，3，6，12，24，48 h。

冷處理：處理前取對照0 h樣品，立即將中間錦雞兒置于4 ℃培養(yǎng)箱，然后根據NaCl處理的取樣時間點取處理后樣品。

ABA處理：處理前取對照0 h樣品，立即向中間錦雞兒葉片噴濃度為100 μmol/L的ABA(加0.05%的Tween)后取樣，然后根據NaCl處理的取樣時間點取處理后樣品。以水(加0.05%的Tween)為對照。

1.3 中間錦雞兒總RNA提取與反轉錄

中間錦雞兒樣品在液氮條件下低溫研磨，取60～70 mg按照總RNA試劑盒步驟提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和是否降解，同時，使用超微量紫外分光光度計對RNA濃度進行測量。選取2 μg濃度較高且純度較好的RNA，反轉錄生成cDNA，作為基因克隆的模板。

1.4 CiATAF1基因克隆

在PrimeSTAR酶的催化下，PCR擴增條件：98 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃補充延伸10 min，30個循環(huán)。

基于上述實驗數據通過式(7)計算得到最大的評價模型值為21.326 8,可以將溫度變量分為5類:(1)T1～T3,T5,T7～T17,T19,T20,T25,T28(2)T4,T6,T21～T24,T26;(3)T18;(4)T27;(5)T29。則根據溫度和軸向熱誤差的相關系數,最終選取5個候選溫度分別為T18、T19、、T24、T27、T29。雖然評價模型確保每個溫度分組內變量的緊密度和分組間的最大距離,但不能完全消除候選溫度之間的共線性。為進一步消除共線性,在SIR建模時引入了主成份分析。

1.5 CiATAF1基因亞細胞定位

取5～7個21 d左右野生型擬南芥葉片，經纖維素酶和離析酶酶解，獲得野生型擬南芥原生質體。稀釋原生質體至濃度為每毫升200 000個，取100 μL原生質體同20 μgCiATAF1-GFP重組質粒混勻，在PEG介導下CiATAF1基因瞬時表達。黑暗條件下，25 ℃培養(yǎng)16 h。在熒光顯微鏡下，觀察CiATAF1-GFP重組質粒亞細胞定位情況。

1.6 中間錦雞兒CiATAF1基因生物信息學分析

CiATAF1基因序列在NCBI網站分析(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；通過PlantCARE在線數據庫(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析CiATAF1啟動子順式作用元件[15]；通過ExPASY在線數據庫(https：//www.expasy.org/resources)中ProtParam預測分析CiATAF1蛋白質理化性質；通過SOMPA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma .html)在線分析CiATAF1蛋白二級結構[16]。

2 結果與分析

2.1 CiATAF1基因克隆

從內蒙古植物逆境生理與分子生物學重點實驗室的干旱轉錄組數據庫中獲得CiATAF1基因序列，經比對分析，該序列沒有完整開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，且兩端均不完整。設計3′-RACE引物(RACE-ATAF1-sense)和5′-RACE引物(RACE-ATAF1-anti)，以中間錦雞兒cDNA為模板，按照RACE體系進行PCR擴增。產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，測序分析后，將2次RACE序列同已有基因序列拼接，獲得CiATAF1基因全長，共1 805 bp，包括完整ORF及非編碼區(qū)。

在已獲得基因序列基礎之上，設計CiATAF1基因全長特異性引物GFP-ATAF1-sense和GFP-ATAF1-anti。以中間錦雞兒cDNA為模板，PCR擴增獲得CiATAF1基因ORF全長序列(圖1)，共873 bp。同時，以中間錦雞兒gDNA為模板，增加延伸時間至2 min，其他條件不變，獲得CiATAF1基因gDNA全長(圖1)，共1 445 bp。

2.2 CiATAF1基因序列分析

CiATAF1基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列分析(圖2)，CiATAF1基因組DNA序列全長為1 445 bp，由2個內含子和3個外顯子構成。ORF全長為873 bp，編碼291個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，圖中大寫字母表示編碼區(qū)序列，小寫字母表示非編碼區(qū)序列。NCBI網站Blast分析表明，CiATAF1基因具有完整的NAC結構域，位于28-105個氨基酸，是典型的NAC轉錄因子家族基因。

圖2 CiATAF1基因的全長序列及推導的氨基酸序列Fig.2 Full-length and deduced amino acid sequences of CiATAF1

2.3 CiATAF1基因啟動子克隆及順式作用元件分析

設計并獲得CiATAF1基因啟動子克隆引物ATAF1-SP1、ATAF1-SP2、ATAF1-SP3，以中間錦雞兒gDNA為模板，通過染色體步移法，克隆CiATAF1基因側翼啟動子序列(圖3)。經過3輪PCR擴增，獲得特異性條帶，長度在750～1 000 bp，回收該片段，并經測序分析，該片段為CiATAF1基因的啟動子。

M.DL5000; 1.第1輪PCR; 2.第2輪PCR; 3.第3輪PCR。M.DL5000 DNA Marker; 1.The first round of PCR; 2.The second round of PCR; 3.The third round of PCR.

擴增獲得CiATAF1基因啟動子序列為826 bp。經PlantCARE在線分析(表2)，該啟動子序列除真核生物普遍具有的TATA-box和CAAT-box之外，還包括許多光響應元件(G-Box、GT1-motif、Sp1等)、植物激素脫落酸響應元件(ABRE)、厭氧誘導相關元件(ARE)以及MYB結合位點(MBS)。

表2 CiATAF1基因啟動子順式作用元件分析Tab.2 CiATAF1 promotor cis-acting elements analysis

2.4 CiATAF1基因亞細胞定位

經NcoⅠ和SpeⅠ內切酶催化，將CiATAF1基因片段從克隆載體pEASY-Blunt Simple酶切并回收，連接線性化pCAMBIA302-GFP載體。連接成功后通過NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切驗證，如圖4，產生約為1 000 bp長的片段，表明重組質粒構建成功。

M.DL5000; 1.CiATAF1-GFP融合表達載體對照; 2.雙酶切CiATAF1-GFP融合表達載體。M.DL5000 DNA Marker;1.CiATAF1-GFP fusion expression vector control; 2.Double enzymes digestion of CiATAF1-GFP fusion expression vector.

PEG法分別轉化35S∶ GFP空載體與CiATAF1-GFP融合表達載體至擬南芥原生質體，觀察亞細胞定位情況。在熒光顯微鏡下，如圖5，35S∶ GFP空載體的綠色熒光蛋白分布于整個細胞，而CiATAF1-GFP融合表達載體的綠色熒光蛋白集中分布于細胞核中。該試驗證明CiATAF1基因同一般其他轉錄因子類似，在細胞核中行使其轉錄調控功能。

2.5 CiATAF1基因組織特異性表達

以中間錦雞兒根、莖、葉及整株的cDNA為模板，熒光定量PCR檢測CiATAF1基因組織表達特異性。結果表明，CiATAF1基因在中間錦雞兒葉片中表達量最高，在根中表達量最少(圖6-A)。

2.6 CiATAF1基因在不同脅迫條件下表達分析

以干旱、NaCl、冷、ABA處理后中間錦雞兒cDNA為模板，檢測CiATAF1基因在脅迫處理下表達情況。在干旱處理條件下，CiATAF1基因從第3天開始到第12天，表達量持續(xù)增加，復水3 d后，基因表達量恢復到處理前水平(圖6-B)；在NaCl處理條件下，CiATAF1基因從0.5 h開始表達量增加，在48 h時，表達量開始下降，但處理過程總體基因表達量變化不大(圖6-C)；冷處理后，CiATAF1基因在0.5～1 h沒有顯著變化，從3 h開始，該基因表達量增加，直到冷處理后48 h(圖6-D)；以水作為處理對照(圖6-E)，經ABA處理后，CiATAF1基因除了在0.5 h表達量略高外，整體上在0～12 h內表達量呈現(xiàn)上升趨勢，并在12～24 h表達量達到最高，約為處理前的6倍(圖6-F)。試驗表明，CiATAF1基因在干旱、鹽、冷以及植物激素ABA處理下表達上調，預測該基因可能參與植物非生物脅迫應答機制的調控。

圖5 CiATAF1基因在擬南芥葉肉原生質體亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of CiATAF1 in Arabidopsis mesophyll protoplast

圖6 CiATAF1基因表達模式分析Fig.6 Analysis of CiATAF1 gene expression patterns

2.7 CiATAF1多重序列比對

CiATAF1蛋白序列同模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)和豆科其他植物鷹嘴豆(Cicerarietinum)、紅車軸草(Trifoliumpratense)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinemax)、赤豆(Vignaangularis)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、綠豆(Vignaradiatavar.radiata)、落花生(Arachishypogaea)以及狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)的同源基因進行多序列比對分析，如圖7。序列一致性為81.14%，CiATAF1在各植物中保守性較強，主要集中在氨基末端結構域。

圖7 CiATAF1多重序列比對分析Fig.7 CiATAF1 multiple sequence alignment analysis

2.8 CiATAF1蛋白生物信息學分析

通過ExPASY在線數據庫中ProtParam預測分析，CiATAF1蛋白分子質量為33.194 ku，等電點(Isoelectric point，pI)為7.64，不穩(wěn)定指數(Instability index，Ⅱ)為59.74，平均親水性為(Grand average of hydropathicity，GRAVY)-0.751，屬不穩(wěn)定的親水蛋白。

通過SOMPA在線分析CiATAF1蛋白二級結構，該蛋白的二級結構主要由α-螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲構成。其中，α-螺旋共40個氨基酸，占氨基酸總數的13.75%；β折疊共60個氨基酸，占氨基酸總數的20.62%；無規(guī)則卷曲共191個氨基酸，占氨基酸總數的65.64%。

3 結論與討論

本研究以中間錦雞兒為材料，克隆并分析CiATAF1基因。CiATAF1基因具有完整的NAC結構域，是典型的NAC轉錄因子家族基因。對CiATAF1基因做了不同組織部位和不同非生物脅迫下的定量分析，研究表明CiATAF1基因的表達具有組織特異性，在中間錦雞兒葉片中表達量最高，在根中表達量最低；同時，CiATAF1基因受到干旱、鹽、冷以及植物激素ABA的誘導表達，推測CiATAF1基因可能參與植物非生物脅迫的應答調控。經染色體步移法克隆了CiATAF1啟動子，長度為826 bp。CiATAF1啟動子序列中包括多種光響應元件、植物激素響應元件等。構建CiATAF1-GFP融合表達載體，PEG誘導轉化擬南芥葉片原生質體瞬時表達分析表明，CiATAF1基因定位于細胞核中，這與Lu等[17]研究表明擬南芥ATAF1基因定位于細胞核中的結果一致。

本研究尚未開展CiATAF1基因的功能驗證試驗，但ATAF1是擬南芥NAC轉錄因子家族中發(fā)現(xiàn)較早的基因之一，其結構和功能已經有較為完整的分析。已經有研究表明，擬南芥ATAF1基因通過調控脅迫相關基因表達，參與植物對干旱、高鹽、ABA等非生物脅迫應答[17-19]；另外，在擬南芥生長生理方面，ATAF1基因作為上游衰老激活因子，促進植物衰老[20]。也有研究表明,ATAF1基因促進ABA的合成[21]；He等[22]在棉花中發(fā)現(xiàn)GhATAF1基因促進GhAVP1、GhRD22、GhDREB2A、GhLEA3和GhLEA6等脅迫相關基因表達，且增強植物對病原菌侵染的敏感性。綜上所述，ATAF1基因確實參與到植物生長發(fā)育的各個階段，且參與調控生物及非生物脅迫應答中。在此基礎上，將進一步探究及分析中間錦雞兒CiATAF1基因的功能。