張曉紅，王寒濤，王聰聰，張芳芳，鄧 妍，魏恒玲，胡根海

(1.河南科技學院 生命科技學院，現代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國農業(yè)科學院 棉花研究所，棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000)

棉花是我國重要的纖維作物及經濟作物，在國民經濟中具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位。目前，我國棉花在向新疆轉移的大形勢下，早熟作為育種的重要目標性狀顯得尤為重要[1]。適時開花是早熟棉培育的一個重要指標，也是棉花能否獲得豐產的重要農藝性狀之一[2]。分析花發(fā)育相關基因，對棉花品種熟期改良及實現棉花機械化采收具有重要意義。

磷脂酰乙醇胺結合蛋白(Phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)在自然界廣泛分布。在動物方面的研究表明，PEBP蛋白參與MAPK/ERK信號通路調節(jié)細胞分化、遷移和黏附，參與NF-κB 信號通路調節(jié)細胞凋亡，參與GPCR 信號通路調控G 蛋白的信號轉導等[3-5]。植物中PEBP蛋白主要參與開花調控通路、植株形態(tài)構建和ABA誘導的種子萌發(fā)信號等途徑[6-8]。植物中TFL1(Terminal flower1)是磷脂酰乙醇胺結合蛋白中的1個亞組，該亞組基因的功能大部分集中在開花調控通路。擬南芥中TFL1通過維持莖頂端分生組織和花序分生組織的無限性，延長植株的營養(yǎng)生長過程，從而延遲植株的生殖生長進程[9]。Conti等[10]研究表明，TFL1蛋白能通過運輸到達頂芽，并且調控擬南芥的植株結構，TFL1蛋白還能抑制AP1和LFY基因的表達并且保持花序的無限生長。對TFL1基因啟動子結構的研究發(fā)現，該基因通過在營養(yǎng)器官的分生組織中表達來控制開花時間[11]。Liu等[12]在山茱萸中發(fā)現，ClTFL1過表達轉化擬南芥后，擬南芥開花時間推遲，植株高度增加，頂端花芽和次生花序分枝增多。水稻中TFL1同源蛋白質RCN與Hd3a競爭是通過與14-3-3蛋白結合調控花發(fā)育[13]。棉花中GhTFL1基因與果枝形成發(fā)育相關[14-15]。

本研究依據棉花基因組測序結果[16-17]，以棉花品種中棉所36為材料，克隆GhTFL1b基因，進行組織特異性、激素和脅迫處理，分析其表達模式，對GhTFL1亞組與GhFD進行互作分析，旨在摸清GhTFL1b表達調控的分子機制，從而為棉花早熟分子改良提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用棉花材料包括栽培種和半野生種，栽培種為中棉所36，半野生種為尖斑棉。DNA聚合酶、反轉錄酶、pMD18-T載體、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自天根公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自康為世紀公司；pBI121載體及根癌農桿菌LBA4404由河南科技學院棉花基因工程實驗室制備并保存。

1.2 材料處理及取樣

用于光照試驗的材料種植于中國農業(yè)科學院棉花研究所早熟組人工氣候培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為長日照。二葉展平時期，短日照處理7 d，并將處理過后的棉花分2批繼續(xù)培養(yǎng)，1批為長日照，光照/黑暗為14 h/10 h，光照時間為8：00-22：00；另一批為短日照，光照/黑暗為10 h/14 h，光照時間為8：00-18：00，溫度均為28 ℃，子葉展平期到五葉展平期取樣，取樣后快速放入液氮中冷凍，并于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用棉花水培法來研究GhTFL1b在激素(赤霉素、脫落酸和水楊酸)和鹽脅迫(NaCl)處理下的應答模式。所用材料為中棉所36水培苗，室內種植條件為14 h光照/10 h黑暗，溫度為26 ℃。于三葉期水培液中增加激素和脅迫處理，以清水為對照。所用水楊酸(Salicylic acid，SA)濃度為200 μmol/L，脫落酸(Abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellins，GA)濃度為100 μmol/L，分別于處理后1，3，7，12，24 h進行根部取樣，選取10株左右水培苗剪下幼嫩根部，吸取根部水分后液氮冷凍，并于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，試驗重?次，利用GraphPad Prism 5軟件進行作圖及統(tǒng)計分析。

1.3 生物信息學分析

研究中所用到的氨基酸序列下載自NCBI網站，使用ClustalX2軟件進行多重序列比對，使用MEGA 6.06最大似然方法構建進化樹。利用Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)對蛋白質理化性質進行預測和分析，并用CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)數據庫對其結構域進行預測。采用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子區(qū)域順式作用元件。

1.4 基因定量表達分析

使用天根多糖多酚RNA提取試劑盒提取RNA，所使用RNA的質量必須保證OD260/280為1.8～2.1，OD260/230大于1.8。使用TaKaRa RR047A試劑盒進行反轉錄，使用gDNA Eraser消化總RNA中殘留的基因組DNA，進行15 min的反轉錄，合成cDNA。使用SYBR Green分析法進行熒光定量，所用試劑盒為TaKaRa RR420A，所用儀器為Applied Biosystems Q6實時熒光定量PCR儀。棉花中以ACTIN為內參，所用引物見表1。

1.5 重組載體構建和酵母轉化

載體pGBKT7、pGADT7以及菌株Y2H和 Y187購自Clontech。以cDNA為模板，通過特異性Infusion引物擴增FD和GhTFL1亞組基因在棉花中的CDS，所用引物見表1。利用限制性內切酶EcoRⅠ和SacⅠ雙酶切載體pGADT7，利用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切載體pGBKT7，形成黏性末端，利用Infusion連接試劑盒進行連接。將連接后的新鮮菌液送金唯智生物科技有限公司測序，并保存測序正確的單克隆菌液以供后續(xù)試驗使用。參考Zhang等[18]的方法進行酵母轉化和酵母雙雜交試驗。

表1 棉花GhTFL1b基因克隆及 表達所用引物(GhTFL1a、GhTFL1c、GhTFL1d)Tab.1 Primers used in GhTFL1b gene cloning and expression in upland cotton

2 結果與分析

2.1 棉花GhTFL1b基因的序列分析

棉花GhTFL1亞組中有4個基因，分別是GhTFL1a、GhTFL1b、GhTFL1c和GhTFL1d。GhTFL1b基因位于棉花A亞組第11號染色體上，編碼框長519 bp，編碼172氨基酸。經理化性質預測可知，其編碼蛋白質分子質量約為19.6 ku，等電點為9.41。進化樹分析結果表明，棉花GhTFL1b與擬南芥AtTFL1親緣關系相近(圖1-A)。根據TAIR網站(http：//www.arabidopsis.org/)提供的擬南芥TFL1氨基酸序列進行序列比對，該氨基酸序列具有比較保守的磷脂酰乙醇胺結合蛋白結構域(圖1-B)。

A.進化樹分析；B.氨基酸多重序列比對；*代表氨基酸完全一致，AtBFT、AtTFL1、AtATC序列號分別為NM_125597、U77674、NM_128315。A.Phylogenetic analysis of GhTFL1 and their homologous genes in Arabidopsis; B.Alignment of amino acid sequences of GhTFL1b and their homologous genes in Arabidopsis; *indicated the same amino acid，the ID of AtBFT，AtTFL1 and AtATC is NM_125597，U77674 and NM_128315，respectively.

2.2 GhTFL1b基因的表達分析

對GhTFL1b基因進行組織表達特異性分析表明，該基因在花中表達量最高，其次是頂芽和根(圖2)。為研究GhTFL1b是否受光周期影響，利用光周期試驗處理半野生種和栽培種材料，對不同時期幼苗葉片取樣分析(圖3)。結果表明，GhTFL1b在半

圖2 棉花GhTFL1b組織特異性表達Fig.2 Organ-specific expression of GhTFL1b in cotton

野生種和栽培種中表達量無明顯變化趨勢。該結果說明，GhTFL1b基因在花中優(yōu)勢表達，而且從半野生種到栽培種的進化過程中，GhTFL1b對不同光照條件變化趨勢不敏感。

圖3 棉花GhTFL1b在栽培種和半野生種中表達模式Fig.3 Expression patterns of GhTFL1b genes in cultivated cotton and semi-wild cotton

2.3 GhTFL1b啟動子分析及其對外源激素的應答

GhTFL1b基因擁有磷脂酰乙醇胺結合蛋白的保守結構域，因此分析啟動子的順式作用元件對于揭示GhTFL1b的功能非常必要。從中棉所棉花基因組數據庫中獲取GhTFL1b基因起始密碼子上游2 000 bp的序列，并利用PlantCARE數據庫對其順式作用元件進行預測。結果如表2所示，該基因的啟動子主要存在2大類順式作用元件，一類是光響應元件和生物鐘節(jié)律響應元件，一類是脅迫響應元件，如與脅迫相關的茉莉酸、脫落酸和干旱脅迫等元件，表明GhTFL1b的表達可能受光、生物鐘、逆境及植物激素等的調控。

表2 棉花GhTFL1b啟動子順式作用元件預測Tab.2 The predicted cis-acting elements of GhTFL1b promoter in cotton

脅迫響應24 h內GhTFL1b表達量變化如圖4。經SA處理3 h后GhTFL1b的表達量開始下降，7 h降到最低值(圖4-A)。經ABA處理(圖4-B)1 h后GhTFL1b表達量開始下降，到3 h達到最小值，隨后開始上升。經GA處理后(圖4-C)，GhTFL1b的表達量與對照相比，在3 h達到峰值，隨后開始下降。鹽脅迫后GhTFL1b表達量從3 h開始持續(xù)上升，到24 h到達最高，表達量約是對照組的6.4倍(圖4-D)。以上結果表明，SA能抑制棉花GhTFL1b的表達，鹽脅迫能促進GhTFL1b的表達，而ABA和GA對GhTFL1b的轉錄無明顯作用，GhTFL1b可以響應SA和鹽脅迫。

圖4 棉花水培苗經過處理后24 h內GhTFL1b基因表達量Fig.4 GhTFL1b expression profiles in the first 24 hours after the cotton seeding were treated using hydroponics

2.4 GhTFL1亞組與GhFD蛋白的互作

GhFD是一個b-ZIP轉錄因子[18]，該基因在莖端分生組織中優(yōu)勢表達(圖5-A)。克隆棉花GhFD基因，連接到pGBKT7載體，檢測是否有自我激活活性和毒性。結果表明，該蛋白質無毒性，但是存在自我激活活性。將GhFD連接到pGADT7載體，將GhTFL1a/GhTFL1b/GhTFL1c/GhTFL1d蛋白分別連接到pGBKT7載體。雙菌株Y187和Y2H混合培養(yǎng)結果顯示，GhFD蛋白與GhTFL1b存在互作(圖5-B)。

3 結論與討論

開花是棉花的重要農藝性狀之一?；ㄆ诘脑缤碛绊懏a量的高低，也影響品種的區(qū)域適應性。隨著棉花基因組的測序完成[16-17]，對棉花功能基因進行的相關研究越來越多[19-21]，而針對棉花開花基因啟動子的分析和蛋白質表達調控等的研究相對較少。從棉花基因組數據庫中共檢索到4條TFL1亞組基因，本研究克隆了GhTFL1b，組織表達和蛋白質調控分析表明，GhTFL1b可以響應水楊酸和鹽脅迫，該基因編碼的蛋白質可與轉錄因子GhFD蛋白進行互作。

水楊酸是與植物脅迫相關的重要激素，也是遮蔭條件下改善植物光合作用并延長花期的重要因子[22]，其不僅能依賴CO基因調控的光周期途徑調節(jié)植物花期，也可以通過抑制開花負調控因子FLC在自主途徑中促進開花[23-24]。鹽脅迫是常見的一種逆境條件，會對植物根系細胞結構產生較大影響，如質膜透性增大，脂質過氧化作用增強，脯氨酸含量增加等[25-26]。擬南芥TFL1家族中BFT基因在高鹽脅迫下通過介導FT-FD模型提供合適的保護機制，適應光周期途徑并促使開花[27-28]。本研究結果表明，鹽脅迫處理后GhTFL1b基因高調表達，水楊酸誘導可使其表達受到抑制，光周期變化不影響該基因表達模式。

AD.轉錄激活結構域；BD.DNA結合結構域。AD.Activation domain; BD.DNA binding domain.

FD屬于b-ZIP轉錄因子，擬南芥FD蛋白能結合FT和TFL1調控開花時間和花的發(fā)育[29-30]。棉花基因組有10個GhFD基因，其中5條來自A組，5條來自D組[31]。Prewitt等[15]研究證實其中1個棉花FD蛋白與GhSP、GhTFL1、GhBFT蛋白互作。本研究結果也表明，棉花中1個GhFD能與GhTFL1b互作。棉花其余幾個FD蛋白與磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族間的關系還有待進一步研究。

棉花GhTFL1b與擬南芥TFL1親緣關系相近。擬南芥TFL1基因能延遲開花時間[30]，黃瓜方面的研究表明CsTFL1b能推遲開花并影響花序形態(tài)發(fā)育[32]。馬鈴薯StCEN能調節(jié)莖尖分生組織的發(fā)育，進一步調控株型發(fā)育[33]。因此，還需通過轉基因棉花驗證，并對轉基因后代株系進行脅迫處理，進一步研究掌握GhTFL1b基因的功能。