唐 琦，鄔碧波，李 林，郝曉萍， 胡小華，張黎明*

(1.上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200070；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院腎內(nèi)科，解放軍腎臟病研究所，上海 200003)

特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是成人腎病綜合征的一個(gè)常見(jiàn)病理類型。目前已知IMN患者體內(nèi)可能存在多種針對(duì)不同自身抗原的抗體，而腎小球足細(xì)胞上的抗磷脂酶A2受體(phospholipase A2receptor，PLA2R)為其主要抗原，患者血清中可檢測(cè)到抗PLA2R抗體，并主要以IgG4形式存在，循環(huán)中抗 PLA2R 抗體與腎小球上的 PLA2R 抗原結(jié)合形成原位免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，致使尿蛋白產(chǎn)生[1]。國(guó)外報(bào)道血清抗PLA2R抗體水平與尿蛋白、疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后密切相關(guān)[2-4]，目前國(guó)內(nèi)將PLA2R抗體作為IMN生物標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道較少。本研究采用激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺方案治療IMN患者，觀察血清抗PLA2R抗體在IMN診斷和病情嚴(yán)重程度評(píng)估中的作用，為今后IMN的免疫治療提供臨床依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年1月至2017年6月在上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院和海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院腎內(nèi)科住院患者60例，其中男34例，女26例，年齡28～72歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)皮腎穿刺活檢后病理證實(shí)為IMN，光鏡下無(wú)明顯系膜增生，無(wú)細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫熒光以IgG及C3沉積為主，電鏡下無(wú)內(nèi)皮下及系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積；(2)既往無(wú)激素和免疫制劑治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)系統(tǒng)性紅斑狼瘡；(2)HIV、梅毒、乙肝、丙肝病毒感染者；(3)肝功能異常：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)超過(guò)正常值上限1.5倍；(4)使用金制劑或青霉胺；(5)惡性腫瘤、糖尿病、妊娠或哺乳期婦女。本研究經(jīng)上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并同意，所有患者入組前均簽署知情同意書。

1.2 儀器和試藥 DM 2500正置熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡儀器有限公司)。PLA2R抗原試劑盒(德國(guó)歐盟公司)；PLA2R抗體試劑盒(美國(guó)DAKO公司)；潑尼松片(上海上藥信誼有限公司)；環(huán)磷酰胺注射劑(美國(guó)國(guó)際百特有限公司)。

1.3 血清抗PLA2R抗體檢測(cè)和分組 所有患者空腹抽血，采用間接免疫熒光法檢測(cè)血清抗PLA2R抗體，以PLA2R 轉(zhuǎn)染的 pcDNA3.1/Hygro-PLA2R作為底物，患者待檢血清作為第一抗體，羊抗人IgG-FTFC作為第二抗體。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試劑盒提供陰性及陽(yáng)性對(duì)照。60例IMN患者根據(jù)血清抗PLA2R抗體結(jié)果，分為血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性組(抗PLA2R+組)44例，血清抗PLA2R抗體陰性組(抗PLA2R-組)16例。

1.4 腎組織PLA2R檢測(cè) 對(duì)確診IMN的患者留取腎活檢組織的冰凍切片，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腎組織PLA2R表達(dá)，檢測(cè)時(shí)用磷酸鹽緩沖液沖洗，蘇木素復(fù)染，干燥后封片，用顯微鏡觀察。

1.5 治療方法 患者均采用改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO)推薦的激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺方案治療，潑尼松初始劑量為1 mg·kg-1·d-1，上限60 mg。如腎病綜合征緩解，繼續(xù)原方案治療2周后激素減量；若未緩解，激素治療3個(gè)月后逐漸減量；環(huán)磷酰胺采用靜脈給藥，0.5～0.75 g/m2，前6個(gè)月每月給藥1次，后6個(gè)月每?jī)蓚€(gè)月給藥1次。同時(shí)給予患者相應(yīng)支持治療。

1.6 觀察指標(biāo) 兩組均檢測(cè)基線和治療3、6、9、12個(gè)月時(shí)24 h尿蛋白、血清白蛋白、ALT、血尿素氮、血肌酐，檢測(cè)基線、治療12個(gè)月血清抗PLA2R抗體等指標(biāo)。估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)計(jì)算采用慢性腎臟病流行病學(xué)合作組(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI)的公式。

1.7 療效評(píng)價(jià)[5](1)完全緩解：24 h尿蛋白<0.3 g/d，且血清白蛋白> 35 g/L，血肌酐正常。(2)部分緩解：24 h尿蛋白下降超過(guò)基礎(chǔ)值50%，且血清白蛋白正常或改善，血肌酐穩(wěn)定。(3)未緩解：治療未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 不良事件 記錄治療期間發(fā)生的各種藥品不良反應(yīng)(ADRs)，如感染、皮疹、胃腸道反應(yīng)、肝功能受損、惡性腫瘤， ALT或AST超過(guò)正常值上限2倍定義為肝功能受損。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 兩組患者在入組時(shí)的年齡、24 h尿蛋白、尿白蛋白與肌酐比、血清白蛋白、血尿素氮、血肌酐、ALT、eGFR等指標(biāo)方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性，具體見(jiàn)表1。

2.2 24 h尿蛋白檢測(cè)結(jié)果 治療3個(gè)月后，抗PLA2R-組患者24 h尿蛋白低于同期抗PLA2R+組(P<0.05)，低于基線(P<0.01)。治療3個(gè)月時(shí)，抗PLA2R+組24 h尿蛋白有下降， 但與基線比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療6個(gè)月后，抗PLA2R+組24 h尿蛋白低于基線，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

組別n年齡(歲)性別(男/女)24 h尿蛋白(g/d)尿白蛋白/肌酐(g/g)血清白蛋白(ρB/g·L-1)血肌酐(cB/μmol·L-1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(zB/U·L-1)總膽固醇(cB/mmol·L-1)三酰甘油cB/mmol·L-1)eGFRa(ml·min-1 ·1.73 m-2)血清抗PLA2R 抗體陽(yáng)性組4449±1526/208.2±3.86.6±3.423.1±5.278±7.210±5.47.5±2.43.1±1.391±15血清抗PLA2R 抗體陰性組1646±178/67.5±3.36.9±4.024.8±4.776±6.911±4.57.2±2.63.3±1.493±16

PLA2R：磷脂酶A2受體；a：計(jì)算采用慢性腎臟病流行病學(xué)合作組(CKD-EPI)的公式；eGFR：估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率

圖1 兩組患者24 h尿蛋白的比較Figure 1 Comparison of 24-h urinaryprotein between the two groups○：血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性組；●：血清抗PLA2R抗體陰性組；*P<0.05，與血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性組比較；△△P<0.01，與同組基線時(shí)比較；PLA2R：磷脂酶A2受體

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 治療3個(gè)月后，抗PLA2R-組血清白蛋白水平高于基線和同期抗PLA2R+組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療3個(gè)月時(shí)，抗PLA2R+組血清白蛋白水平與基線比較無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療6個(gè)月后，抗PLA2R+組血清白蛋白水平高于基線，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。治療3、6、9、12個(gè)月，抗PLA2R+組血尿素氮、血肌酐、eGFR有上升趨勢(shì)，但與基線比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血清ALT無(wú)明顯變化?？筆LA2R-組以上4項(xiàng)指標(biāo)在治療過(guò)程各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與基線比較無(wú)明顯變化。

圖2 兩組患者血清白蛋白的比較Figure 2 Comparison of serum albumin between the two groups○：血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性組；●：血清抗PLA2R抗體陰性組；**P<0.01，與血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性組比較；△△P<0.01，與同組基線時(shí)比較；PLA2R：磷脂酶A2受體

2.4 療效 治療6個(gè)月，抗PLA2R+組的8例患者(18.2%)完全緩解，13例(29.5%)部分緩解，總緩解21例(47.7%)；抗PLA2R-組6例(37.5%)完全緩解，9例(56.3%)部分緩解，總緩解15例(93.8%)，抗PLA2R-組總緩解率高于抗PLA2R+組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.526 3，P<0.01)。治療12個(gè)月，抗PLA2R+組的11例患者(25%)完全緩解，14例(31.8%)部分緩解，總緩解25例(56.8%)；抗PLA2R-組15例(93.7%)完全緩解，1例(6.3%)部分緩解，總緩解16例(100%)，抗PLA2R-組總緩解率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.213 8，P<0.01)，詳見(jiàn)圖3。

2.5 血清抗PLA2R抗體檢測(cè)結(jié)果 60例IMN患者在基線時(shí)檢測(cè)血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性為44例，陽(yáng)性率73.3%。44例抗PLA2R抗體陽(yáng)性患者予免疫抑制劑治療12個(gè)月后復(fù)測(cè)血清抗PLA2R抗體，11例完全緩解患者的血清抗PLA2R抗體全部轉(zhuǎn)陰；14例部分緩解患者的血清抗PLA2R抗體轉(zhuǎn)陰8例，6例仍是陽(yáng)性；19例未緩解患者的血清抗PLA2R抗體全部沒(méi)有轉(zhuǎn)陰。

2.6 腎組織PLA2R檢測(cè)結(jié)果 60例入選IMN患者，腎組織PLA2R檢測(cè)陽(yáng)性44例，其中23例可見(jiàn)腎組織PLA2R沿腎小球毛細(xì)血管襻呈顆粒狀沉積，彌漫性著色，為強(qiáng)陽(yáng)性；21例沿腎小球毛細(xì)血管襻呈顆粒狀沉積，節(jié)段性或彌漫性著色，為弱陽(yáng)性?；€時(shí)血清抗 PLA2R 抗體檢測(cè)陽(yáng)性患者，其腎組織PLA2R表達(dá)也全部呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖4。

圖4 腎組織PLA2R表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Figure 4 Expression of PLA2R in renal tissues (immunohistochemical staining，×400)A：PLA2R弱陽(yáng)性，B：PLA2R強(qiáng)陽(yáng)性

2.7 ADRs 患者在12個(gè)月試驗(yàn)期間均未出現(xiàn)服藥有關(guān)肝功能受損、骨髓抑制、嚴(yán)重感染、惡性腫瘤等。

3 討 論

膜性腎病的病理特點(diǎn)是腎小球基底膜上皮下免疫復(fù)合物沉積及基底膜彌漫性增厚。一般認(rèn)為，循環(huán)免疫復(fù)合物沉積或原位免疫復(fù)合物形成導(dǎo)致的免疫反應(yīng)是 IMN 的主要發(fā)病機(jī)制。2009年，Beck等[6]在IMN患者血清中首次檢測(cè)出抗PLA2R抗體，一系列針對(duì)血清抗PLA2R抗體的研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，70%～80%的IMN患者血清中可檢測(cè)出抗PLA2R抗體，由此推測(cè)該抗體對(duì)于IMN是存在致病性的，抗PLA2R 抗體可能是IMN具有診斷意義的生物標(biāo)志物[4,7]。近期有小樣本研究顯示，血清PLA2R抗體水平與患者臨床病情和藥物療效相關(guān)[8-10]，但國(guó)內(nèi)針對(duì)抗 PLA2R 抗體作為 IMN 生物標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示，60例患者血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性率為73.3%%，與Beck等[3]和宋東旭等[11]的報(bào)道一致。24 h蛋白尿和血清白蛋白水平是評(píng)估IMN疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，在IMN中血清抗PLA2R抗體出現(xiàn)與患者大量蛋白尿、低蛋白血癥相關(guān)[2,9,10]。本研究結(jié)果顯示，治療3個(gè)月，抗PLA2R-組24 h尿蛋白、血清白蛋白恢復(fù)情況優(yōu)于抗PLA2R+組；治療6個(gè)月，抗PLA2R+組和抗PLA2R-組總緩解率分別為47.7%和93.8%；治療12個(gè)月總緩解率分別為56.8%和100%。這表明血清抗PLA2R抗體陰性IMN患者達(dá)到臨床緩解時(shí)間短于血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性患者，血清抗PLA2R抗體陰性IMN采用免疫抑制治療的療效更佳，對(duì)于免疫治療的早期反應(yīng)更為敏感。PLA2R是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，存在于人類正常足細(xì)胞中，患者血清抗PLA2R抗體能與相應(yīng)受體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球毛細(xì)血管襻和基底膜并進(jìn)一步激活補(bǔ)體，導(dǎo)致足細(xì)胞病變，產(chǎn)生蛋白尿。Skoberne等[12]的體外實(shí)驗(yàn)證明攜帶PLA2R抗體的患者血清能干擾足細(xì)胞在體外黏附Ⅳ型膠原，從而影響足細(xì)胞的功能。

本研究也顯示，44例抗PLA2R抗體陽(yáng)性患者予免疫抑制治療12個(gè)月后復(fù)測(cè)血清抗PLA2R抗體，11例完全緩解患者的血清抗PLA2R抗體全部轉(zhuǎn)陰；14例部分緩解患者的血清抗PLA2R抗體轉(zhuǎn)陰8例，其余6例仍是陽(yáng)性；19例未緩解組的血清抗PLA2R抗體全部沒(méi)有轉(zhuǎn)陰。這說(shuō)明血清抗PLA2R抗體隨病情緩解而轉(zhuǎn)陰，與疾病近期轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。Beck等[3]對(duì)25例血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性的IMN患者采用利妥昔單抗治療，發(fā)現(xiàn)抗體滴度下降或轉(zhuǎn)陰的患者臨床容易達(dá)到緩解。黃俊等[13]用他克莫司聯(lián)合激素治療血清抗PLA2R抗體持續(xù)高滴度的難治性IMN，發(fā)現(xiàn)對(duì)常規(guī)免疫抑制劑治療無(wú)反應(yīng)成為難治性IMN時(shí)，其血清抗PLA2R抗體一直在高滴度水平，提示其自身免疫反應(yīng)未緩解。

本研究發(fā)現(xiàn)血清抗PLA2R 抗體檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的IMN患者，其腎小球PLA2R的免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果也是陽(yáng)性，說(shuō)明這兩種檢測(cè)方法都對(duì)IMN診斷有重要價(jià)值，但采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腎組織PLA2R表達(dá)需依賴腎活檢穿刺術(shù)，有創(chuàng)操作對(duì)患者有一定風(fēng)險(xiǎn)，而血清抗PLA2R 抗體檢測(cè)取材方便、安全，且檢測(cè)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單。除此以外，有研究發(fā)現(xiàn)治療有效的IMN患者，血清抗PLA2R抗體滴度的下降常先于尿蛋白減少及疾病緩解[14-15]。因此提示不但在治療前及治療結(jié)束時(shí)要檢測(cè)患者血清抗PLA2R抗體水平，而且在治療過(guò)程中也需定期監(jiān)測(cè)血清抗體變化來(lái)評(píng)估治療敏感性及疾病轉(zhuǎn)歸。Kanigicherla等[16]觀察患者5年，發(fā)現(xiàn)血清抗PLA2R抗體滴度最高的1/3患者，其血肌酐升高至基線水平兩倍的風(fēng)險(xiǎn)較大，預(yù)后較差。本研究只追蹤患者12個(gè)月，抗PLA2R+組的血肌酐和eGFR有上升趨勢(shì)，但與基線比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此還需延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，并擴(kuò)大研究樣本量以期進(jìn)一步明確。

總之，血清抗PLA2R抗體是IMN的特異性生物標(biāo)志物，血清抗PLA2R抗體陽(yáng)性的患者免疫治療效果差，IMN患者檢測(cè)血清抗PLA2R抗體有助于判斷病情，對(duì)于其在治療策略的選擇、病情的監(jiān)測(cè)具十分重要的意義。