魯 悅，戴 琪，武 鑫，任福正*

(1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237；2.上海維洱實驗室，上海 200433)

外泌體(exosomes)廣泛存在于人體的各種體液中，是一種由細(xì)胞主動分泌的納米級囊泡，內(nèi)含多種蛋白質(zhì)和核酸分子，在細(xì)胞間信息傳遞的過程中起著重要作用。外泌體是由Johnstone等[1]從綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中首次分離純化得到，過去人們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞向外界排出的廢物，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的活動在腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境的信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體(即腫瘤外泌體)成分特殊，可以用作腫瘤檢測的生物標(biāo)記物。此外，外泌體獨特的結(jié)構(gòu)也使其適用于靶向藥物傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建，有助于實現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶向傳遞。本文將從外泌體的來源及生物學(xué)功能入手，詳細(xì)綜述外泌體在腫瘤靶向診療中的應(yīng)用。

1 外泌體的來源

外泌體是一種由細(xì)胞主動分泌的膜囊泡，直徑為40～100 nm，廣泛存在于尿液、精液[2]、唾液[3]、血液[4]等多種體液中。外泌體的形成從細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)涵體(early endosome)開始，隨后mRNA、蛋白質(zhì)分子等開始在早期內(nèi)涵體內(nèi)聚集，早期內(nèi)涵體在轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)吞體分選復(fù)合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)及其他相關(guān)蛋白質(zhì)的調(diào)控下形成多泡體(multivesicular bodies，MVBs)[5]。ESCRT是一系列的胞漿蛋白復(fù)合物，包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ及ESCRT-Ⅲ[6]。關(guān)于多泡體的形成機制，目前在學(xué)術(shù)界尚無定論。多泡體與細(xì)胞膜融合后，以囊泡形式向細(xì)胞外釋放細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)，這些囊泡即為外泌體[5]。

2 外泌體的成分和生物學(xué)功能

外泌體通常攜帶有mRNA、microRNA、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其最主要的生物學(xué)功能是實現(xiàn)細(xì)胞間信息傳遞及免疫應(yīng)答。當(dāng)外泌體與靶細(xì)胞膜融合，其內(nèi)含物會被傳遞至靶細(xì)胞，實現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)交流和信息傳遞，從而調(diào)控細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞來源的外泌體轉(zhuǎn)運的致癌因子與前列腺癌患者脂肪干細(xì)胞致癌重編程密切相關(guān)，這些致癌因子包括H-ras和K-ras轉(zhuǎn)錄物、miR-125b、miR-130b和miR-155，以及GTP酶的Ras超家族 Rab1a、Rab1b和Rab11a[7]，表明腫瘤外泌體在正常細(xì)胞癌變的過程中起到積極作用，促進腫瘤的生成。此外，腫瘤外泌體可通過轉(zhuǎn)運與腫瘤血管新生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，幫助內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進腫瘤血管新生[8]。腫瘤外泌體攜帶的miR-9可以通過影響人乳腺纖維細(xì)胞的性質(zhì)，促進正常纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)的纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9]，加速腫瘤發(fā)展。腫瘤外泌體還具有免疫調(diào)節(jié)特性，可通過與T調(diào)節(jié)細(xì)胞(regulatory T cells)相互作用，增強T調(diào)節(jié)細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抗性，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[10]。

3 外泌體在腫瘤診斷中的應(yīng)用

正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞都會分泌外泌體，但是腫瘤外泌體與正常細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)含物成分差異巨大，檢測腫瘤外泌體所含的蛋白質(zhì)和核酸分子，有助于提高腫瘤診斷的特異性和靈敏性。因此，體液中的腫瘤外泌體可被當(dāng)作“液體活檢”的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中的miR-221、miR-191、let-7a、miR-181a和miR-26a可作為肝臟特異性miRNA表達標(biāo)準(zhǔn)化的最佳基因參照，從而可作為生物標(biāo)記物用于診斷早期肝癌[11]；在前列腺癌患者的尿液中，miR-483-5p表達水平較高[12]；CD44v6、Tspan8、EpCAM和CD104 四種表面蛋白，及miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306四種miRNA在胰腺癌患者血清外泌體中有較高的表達水平[13]。這些研究表明，血漿或血清外泌體所攜帶的miRNA等物質(zhì)有望成為癌癥臨床檢測的生物標(biāo)記物，用于腫瘤的診斷。

4 外泌體在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用

4.1 作為藥物載體 近年來，實現(xiàn)抗癌藥物的靶向傳遞一直是新藥研究的熱點。粒徑<200 nm的納米粒在腫瘤部位有更長的保留時間，因此通常表現(xiàn)出更高效的腫瘤富集效應(yīng)，這一現(xiàn)象被稱作高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)[14]。由于腫瘤組織具有EPR效應(yīng)，因此納米粒是一種比較理想的抗腫瘤藥物靶向載體。外泌體作為天然的細(xì)胞間信息交流使者，有納米級粒徑，再加上其良好的生物相容性，避免了脂質(zhì)體等人造載體的藥物過早泄漏及引發(fā)體內(nèi)免疫反應(yīng)等缺點，在藥物載體領(lǐng)域有更好的優(yōu)勢和更廣闊的應(yīng)用前景。外泌體作為藥物載體在血液中穩(wěn)定性高，免疫源性低，藥物運輸效率高，歸巢靶組織能力和穿過生物屏障能力較強。外泌體的載藥方式有兩種，一種是在外泌體分泌前載藥，包括轉(zhuǎn)染、共孵育等方法；另一種是在外泌體分泌后載藥，包括直接混合、電穿孔等方法。外泌體不僅可用于傳遞小分子化學(xué)抗腫瘤藥物，也可用來傳遞mRNA、miRNA、siRNA等基因藥物，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信息傳遞來調(diào)控腫瘤的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，將外泌體用于傳遞紫杉醇[15]、阿霉素[16]等小分子化學(xué)抗腫瘤藥物時，不僅可以降低藥物毒性，還可以提高藥物在體內(nèi)的生物利用度。此外，也有學(xué)者利用成熟樹突狀細(xì)胞來源的外泌體裝載蛋白質(zhì)類藥物，引發(fā)免疫細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，并嘗試以外泌體為基礎(chǔ)發(fā)展腫瘤疫苗[17]。

利用外泌體的靶向性來裝載抗腫瘤藥物，減少其對正常細(xì)胞的損害，常見方法有以下幾種。(1)利用外泌體表面蛋白與受體細(xì)胞上的受體結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞來源的外泌體能被小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC)主動捕獲[18]，將黑色素瘤細(xì)胞外泌體注射進小鼠體內(nèi)后，外泌體會集中分布于注射點附近的淋巴結(jié)中[19]，這些靶向作用與外泌體膜上存在的復(fù)雜而特殊的蛋白質(zhì)有關(guān)。此外，由于腫瘤微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大，有利于外泌體透過細(xì)胞間隙滲出血管而滯留于腫瘤組織中，被特定的腫瘤細(xì)胞攝取，實現(xiàn)外泌體的被動靶向作用。(2)利用基因工程對外泌體膜進行修飾。由于外泌體自身靶向性較弱且難以控制，利用基因工程技術(shù)對其進行修飾是使外泌體獲得主動靶向性的重要手段之一。Ohno等[20]利用基因工程技術(shù)制備GE11靶向肽修飾的外泌體(GE11-Exos)，并用其將腫瘤抑制性miRNA傳遞至高表達EGFR的乳腺癌組織中，結(jié)果顯示，GE11-Exos在體內(nèi)有良好的靶向性。Alvarez-Erviti等[21]利用基因工程技術(shù)修飾樹突狀母細(xì)胞，使其分泌的外泌體膜上含有能夠與神經(jīng)細(xì)胞膜上Lamp2b蛋白靶向性結(jié)合的狂犬病病毒糖蛋白(rabies viral glycoprotein,PVG)多肽，從而實現(xiàn)外泌體靶向給藥。此外，還有研究者利用疊氮-脂[22]或聚乙二醇類似物[23]連接在外泌體膜，以增強外泌體中抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷力，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間。(3)利用磁納米顆粒技術(shù)對外泌體進行修飾。該技術(shù)是將具有超順磁性的納米粒與外泌體制得的復(fù)合物用作腫瘤藥物的靶向載體。Qi等[24]利用血清外泌體表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和轉(zhuǎn)鐵蛋白特異性結(jié)合，將超順磁粒子和小鼠血清共同孵育，使超順磁粒子與外泌體表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，再通過外加磁場收集外泌體并完成載藥后,注入小鼠體內(nèi)，最后通過在腫瘤部位外加磁場實現(xiàn)外泌體的靶向作用。

4.2 作為腫瘤治療靶標(biāo) 由于外泌體在細(xì)胞間傳遞信息，調(diào)控腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤組織血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移，因此抑制腫瘤外泌體的活動為腫瘤的靶向治療提供了新思路。向Lewis肺癌荷瘤小鼠模型腹腔注射GW4869S(中性鞘磷脂酶2抑制劑)，可降低Lewis腫瘤細(xì)胞外泌體的分泌，從而抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[25]。在黑色素瘤細(xì)胞中，調(diào)控外泌體囊泡形成的RAB27A基因有較高表達，研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾該基因的表達能有效減少黑色素瘤細(xì)胞外泌體的分泌，從而抑制黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移[26]。這些研究結(jié)果均提示，控制外泌體的分泌可能成為腫瘤治療的新靶標(biāo)，可以通過抑制外泌體的分泌達到治療腫瘤的目標(biāo)。

5 展 望

綜上所述，外泌體成分與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前，將外泌體作為腫瘤檢測的生物標(biāo)記物以及腫瘤治療的靶向載體仍是新藥研發(fā)的熱點。外泌體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)可以保護其內(nèi)含物在血液內(nèi)長時間穩(wěn)定地轉(zhuǎn)運，再加上其納米級的粒徑，外泌體被用作抗腫瘤藥物載體也有廣闊的應(yīng)用前景。經(jīng)生物技術(shù)對外泌體表面進行修飾，使其具有很大的潛力成為抗腫瘤藥物的靶向載體。外泌體中包含的蛋白質(zhì)、核酸分子常被用作腫瘤檢測的生物標(biāo)記物，但是由于外泌體內(nèi)所含成分復(fù)雜，且不同來源的外泌體中蛋白質(zhì)和核酸分子的表達水平差異較大，因此將外泌體作為癌癥診斷的生物標(biāo)記物仍處于實驗室研究階段，若想投入臨床應(yīng)用，還需要克服諸多難題。并且外泌體產(chǎn)率較低， 對藥物的包封率也不甚理想， 不同細(xì)胞來源的外泌體成分差異巨大， 因此將外泌體作為抗腫瘤藥物的靶向載體還需要更多的探索。 總之， 外泌體用于腫瘤的生物檢測及抗腫瘤藥物的靶向載體有著廣闊的前景， 但仍需要深入探索。