何俊杰，宋光均，鄧慧萍，蹇華麗*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642) 2(廣州元大生物科技發(fā)展有限公司，廣東 廣州，510530)

蝦青素(astaxanthin)屬于酮式類胡蘿卜素，是一種強(qiáng)抗氧化劑，具有清除自由基，修復(fù)自由基和紫外線導(dǎo)致的細(xì)胞膜和核酸損傷，增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤等功效，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品、飼料添加等領(lǐng)域[1-4]。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素所使用的菌種主要是紅法夫酵母和雨生紅球藻，但因存在產(chǎn)量不高、培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)條件苛刻、提取難度大等方面的問題，一定程度上制約了其生產(chǎn)和應(yīng)用[5-7]；因此，蝦青素產(chǎn)量高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)和大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)蝦青素生物資源一直是人們研究和尋求的目標(biāo)。

本課題組分離獲得1株產(chǎn)蝦青素乳桿菌CHU-R，前期試驗(yàn)表明該菌種同時(shí)具備雨生紅球藻高蝦青素含量和紅發(fā)夫酵母易培養(yǎng)的特點(diǎn)[8-10]，且在蝦青素提取方面表現(xiàn)出優(yōu)良性能，通過分批培養(yǎng)，其蝦青素含量約為20.0 mg/g干菌體[11-13]。本研究擬采用補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)一步提高其生物量及蝦青素產(chǎn)量，通過研究補(bǔ)料方式對(duì)其各指標(biāo)的影響確定最佳補(bǔ)料工藝。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

乳桿菌CHU-R[14](由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：去皮切塊馬鈴薯200.0，蔗糖20.0，瓊脂粉20.0，pH 6.0；種子制備培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜15.0(以總糖含量計(jì))，(NH4)2SO42.0，Na2HPO4·12H2O 1.0，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜20.0(分批發(fā)酵為70.0，以總糖含量計(jì))，(NH4)2SO42.0，Na2HPO4·12H2O 1.0，pH 5.0；補(bǔ)料液濃度(g/L)： 糖蜜200.0(以總糖含量計(jì))，(NH4)2SO420.0，Na2HPO4·12H2O 10.0，pH 4.0～4.5；補(bǔ)料量約占總裝料體積20%，以上培養(yǎng)基的濕熱滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BIOTECH-7BGZ 5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16GR臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Aglinet 1100高效液相儀，Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子制備

將斜面菌種接種于盛有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于28 ℃、180 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)24 h，獲得一級(jí)種子。然后，取2.5 mL一級(jí)種子液置于盛有50 mL新鮮種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于相同條件培養(yǎng)16 h，獲得二級(jí)種子。

1.3.2 5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

分批發(fā)酵：以5% 接種量將二級(jí)種子液接入裝料系數(shù)為0.8的5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度28 ℃，控制溶氧50%左右，壓強(qiáng)0.08 MPa，發(fā)酵pH 5.0(使用15% NaOH和20% H3PO4控制)，溶氧≥50%，培養(yǎng)周期72 h，每8 h取樣測(cè)定菌體干重及蝦青素產(chǎn)量。

以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料分批發(fā)酵：采用流加方式，當(dāng)碳源基本耗盡，即pH較基礎(chǔ)值上升0.5時(shí)開始補(bǔ)料，調(diào)節(jié)流加速率使每次加入發(fā)酵液的糖含量分別為5.0、10.0、15.0、20.0 g/L，直至發(fā)酵液中總補(bǔ)糖量達(dá)50.0 g/L。其余操作條件與分批發(fā)酵相同。

以總糖消耗為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料分批發(fā)酵：采用流加方式，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)呛窟_(dá)到設(shè)定值(3.0～6.0、6.0～9.0和9.0～12.0 g/L)開始補(bǔ)料，直至發(fā)酵液中總補(bǔ)糖量達(dá)50.0 g/L。其余操作條件同分批發(fā)酵。

以過程DO為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料分批發(fā)酵：采用流加方式，當(dāng)DO升高到80%為補(bǔ)料依據(jù)進(jìn)行補(bǔ)料，直至發(fā)酵液中總補(bǔ)糖量達(dá)50.0 g/L，控制DO值分別維持在20%～40%和40%～60%，其余操作條件同分批發(fā)酵。

1.3.3 總糖測(cè)定

參照GB/T 5009.7—2016直接滴定法[15]。

1.3.4 菌體干重測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，除去上層液體，將菌體轉(zhuǎn)移到稱量瓶中，無菌水洗滌2次，置于105 ℃烘箱中干燥至恒重，獲得菌體凈重。根據(jù)取樣液體積，計(jì)算干重濃度(g/L)。細(xì)胞得率計(jì)算如公式(1)：

(1)

1.3.5 蝦青素產(chǎn)量測(cè)定

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取0.001 g蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，美國)，用少量丙酮溶解，并用甲醇定容至10.0 mL，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL。從中取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至2.5、5.0、10.0、 15.0、20.0 μg/mL。使用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蝦青素測(cè)定：吸取一定量細(xì)胞懸浮液，4 000 r/min離心10 min，除去上層液體，無菌水洗滌2次，95%乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌1次，加入一定量二甲基亞砜，將菌體重懸、攪拌均勻后于65.0 ℃水浴1 h，加入適量丙酮，搖勻后于4 000 r/min離心10 min，取上清液采用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18、(4.6×250) mm、5.0 μL；檢測(cè)波長：480 nm；流動(dòng)相：甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫30.0 ℃；進(jìn)樣量：20.0 μL。

蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率的計(jì)算如公式(2)：

(2)

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)(顯著性水平為P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批發(fā)酵

為了研究補(bǔ)料工藝對(duì)乳桿菌CHU-R生長代謝的影響，首先在5 L發(fā)酵罐中對(duì)其進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵過程曲線如圖1所示。

圖1 乳桿菌CHU-R分批發(fā)酵曲線Fig.1 Batch fermentation of Lactobacillus CHU-R

分批發(fā)酵結(jié)果表明，蝦青素積累和菌體生長前期相偶聯(lián)，后期不偶聯(lián)[16]；乳桿菌CHU-R生長的同時(shí)，蝦青素迅速開始積累；當(dāng)乳桿菌CHU-R進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，蝦青素同時(shí)進(jìn)入快速積累期。40 h后，乳桿菌CHU-R對(duì)碳源的總消耗速率減慢，菌體生長速率相應(yīng)放緩，但蝦青素積累速率卻并未減緩，表明菌體的生長和蝦青素積累在不同時(shí)期仍有所側(cè)重；前期主要進(jìn)行菌體生長，而后期主要進(jìn)行蝦青素積累。當(dāng)菌體生長及蝦青素積累速度均漸趨平緩時(shí)，培養(yǎng)液中的殘?zhí)呛咳韵鄬?duì)較高，推斷原因可能是高濃度底物對(duì)菌體生長產(chǎn)生了抑制效應(yīng)或者是產(chǎn)物的反饋抑制影響了乳桿菌CHU-R的生長和蝦青素的積累[17-18]，從而導(dǎo)致了發(fā)酵周期延長，碳源的利用率極低，因此有必要進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。

2.2 以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料方式

以過程pH為依據(jù)的補(bǔ)料方式中，當(dāng)pH略有上升時(shí)表明培養(yǎng)基的營養(yǎng)基本消耗完畢，此時(shí)若補(bǔ)加物料進(jìn)去，有利于乳桿菌的生長，減緩菌體衰老和抑制自溶，促進(jìn)產(chǎn)物蝦青素的積累[19-20]。

發(fā)酵至17 h，pH較基礎(chǔ)值上升0.5時(shí)開始補(bǔ)料，通過流加補(bǔ)料液控制pH值維持在5.0，補(bǔ)料液流加時(shí)長為24 h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)乳桿菌CHU-R共加入物料70.0 g/L糖蜜(以總糖含量計(jì))、7.0 g/L(NH4)2SO4和3.5 g/L Na2HPO4·12H2O。由圖2可知，4種補(bǔ)糖濃度的菌體干重和蝦青素產(chǎn)量變化趨勢(shì)具有相似性，32 h達(dá)到穩(wěn)定期，菌體干重維持在25.0～30.0 g/L。當(dāng)補(bǔ)糖質(zhì)量濃度為20.0 g/L時(shí)，生物量達(dá)到最大值(32.43 g/L)， 不同時(shí)間下的蝦青素產(chǎn)量在40 h前有較顯著差異(最高值為1.39 g/L)，表明以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料模式中，每次補(bǔ)糖后，流加濃度的差異對(duì)乳桿菌CHU-R生長及蝦青素積累雖有一定影響，但幅度不大；綜合考慮成本因素，以流加濃度20.0 g/L 較為合適。在16 h前培養(yǎng)液中的初糖被迅速消耗，因?yàn)樵?7 h進(jìn)行補(bǔ)料，發(fā)酵液中全程保持一定濃度的可利用碳源，菌體可維持一定的生長活力，殘?zhí)堑暮烤S持在3.0～8.0 g/L。與分批發(fā)酵相比，以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料模式能顯著提高乳桿菌CHU-R菌體量、蝦青素積累量及對(duì)殘?zhí)堑睦寐省?/p>

圖2 以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)對(duì)乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effect of process pH as supplementary sugar on fermentation process of Lactobacillus CHU-R

2.3 以總糖消耗為補(bǔ)料依據(jù)的補(bǔ)料方式

以總糖消耗為補(bǔ)料依據(jù)，是補(bǔ)料分批發(fā)酵中較為簡(jiǎn)單有效的一種底物補(bǔ)加策略。在此補(bǔ)料方式中，當(dāng)發(fā)酵至12～16 h殘?zhí)菨舛冗_(dá)到補(bǔ)糖設(shè)定值時(shí)開始補(bǔ)料，通過流加補(bǔ)料液控制殘?zhí)菨舛染S持在設(shè)定值，補(bǔ)料液流加時(shí)長為25～30 h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)乳桿菌CHU-R共加入物料70.0 g/L糖蜜(以總糖含量計(jì))、7.0 g/L(NH4)2SO4和3.5 g/L Na2HPO4·12H2O。如圖3所示，3種補(bǔ)糖方式的菌體干重變化趨勢(shì)具有相似性，差異較?。环€(wěn)定期時(shí)菌體干重維持在25.0～30.0 g/L，最大值為32.96 g/L；然而，不同補(bǔ)糖方式的蝦青素產(chǎn)量具有明顯差異，而且，以6.0～9.0 g/L為設(shè)定值開始補(bǔ)糖的方式所得效果最佳。

圖3 以總糖消耗為補(bǔ)料依據(jù)對(duì)乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程的影響Fig.3 Effect of total sugar consumption on the fermentation process of Lactobacillus CHU-R

這些結(jié)果表明補(bǔ)糖時(shí)機(jī)非常重要，補(bǔ)糖太早，發(fā)酵液中維持較高糖濃度，很可能不利于蝦青素積累。與分批發(fā)酵相比，該發(fā)酵方式，維持了合適的碳源濃度，顯著提高了乳桿菌CHU-R菌體量、蝦青素積累量及對(duì)碳源的利用率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與盧富山等[21]利用葡萄糖反饋流加維持較低的糖濃度從而提高植物乳桿菌數(shù)結(jié)果相似。

2.4 以過程DO為補(bǔ)料依據(jù)的補(bǔ)料方式

由于該乳桿菌產(chǎn)蝦青素是一個(gè)強(qiáng)好氧過程，因此培養(yǎng)液的溶氧濃度是影響菌體生長和蝦青素合成的重要因素。當(dāng)培養(yǎng)液的溶氧降低到一定水平時(shí)，溶氧的供應(yīng)就無法滿足其生長需求[22]，導(dǎo)致蝦青素產(chǎn)量降低。

在該補(bǔ)料工藝中，發(fā)酵至15～16 h開始補(bǔ)料，通過流加補(bǔ)料液控制溶氧濃度維持在設(shè)定值，補(bǔ)料液流加時(shí)長為35 h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)乳桿菌CHU-R共加入物料70.0 g/糖蜜(以總糖含量計(jì))、7.0 g/L (NH4)2SO4和3.5 g/L Na2HPO4·12H2O。由圖4可知，在以過程DO為補(bǔ)料依據(jù)進(jìn)行補(bǔ)料時(shí)，控制溶氧40%～60%的菌體干重和蝦青素產(chǎn)量均高于溶氧20%～40%，且前者的殘?zhí)呛康陀诤笳?。其中，控?0%～60%溶氧的補(bǔ)料方式下，穩(wěn)定期時(shí)，菌體干重保持在33.0～36.0 g/L(最高值39.73 g/L)，蝦青素產(chǎn)量維持在1.20～1.50 g/L。實(shí)驗(yàn)表明，較高的溶氧量使乳桿菌CHU-R充分利用發(fā)酵液中的殘?zhí)?，使殘?zhí)呛烤S持在較低水平，提高了殘?zhí)堑睦寐剩瑥亩龠M(jìn)了乳桿菌CHU-R的生長和提高蝦青素產(chǎn)量。

圖4 以過程DO為補(bǔ)料依據(jù)對(duì)乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程的影響Fig.4 Effect of process DO as feeding basis on fermentation process of Lactobacillus CHU-R

2.5 不同補(bǔ)料方式發(fā)酵結(jié)果比較

根據(jù)上述不同補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果選擇具有代表性時(shí)刻對(duì)3種補(bǔ)料方式的殘?zhí)呛窟M(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)3種補(bǔ)料工藝的殘?zhí)菨舛炔町愶@著(P<0.05)。

圖5 不同補(bǔ)料方式發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度變化趨勢(shì)Fig.5 Trend of residual sugar concentration in fermentation broth with different feeding modes注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料工藝是一種基于響應(yīng)pH值變化的補(bǔ)料策略[23]，因乳桿菌CHU-R是偶聯(lián)的，蝦青素積累可能更多利用發(fā)酵液中的有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致乳桿菌CHU-R未完全利用完發(fā)酵液中的碳源的情況下，觸發(fā)了補(bǔ)料機(jī)制致使補(bǔ)料前期乳桿菌CHU-R對(duì)發(fā)酵液的碳源利用率較低，最終因產(chǎn)物反饋抑制或者滲透壓升高等其他原因使乳桿菌CHU-R生長受到影響。

然而在以總糖消耗為依據(jù)的補(bǔ)料方式中，雖然全程嚴(yán)格控制碳源濃度，使得碳源濃度完全滿足乳桿菌CHU-R的生長需求，但陳敏純等[14]前期研究表明乳桿菌CHU-R生長和蝦青素積累過程是好氧過程，乳桿菌CHU-R的快速生長會(huì)導(dǎo)致氧需求量不斷增加，在此補(bǔ)料策略過程中，發(fā)酵液中的溶氧含量隨著發(fā)酵時(shí)間越來越低，最終因發(fā)酵設(shè)備的供氧能力限制而不能滿足乳桿菌CHU-R對(duì)氧氣的需求，從而抑制了乳桿菌CHU-R的生長，因此發(fā)酵結(jié)果與以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料工藝相似，無法達(dá)到最佳效果。

補(bǔ)料工藝的關(guān)鍵是確保基質(zhì)消耗速率和補(bǔ)料流加速率的平衡，使發(fā)酵過程中基質(zhì)濃度維持在合適范圍，降低滲透壓和菌種生存環(huán)境變動(dòng)以減小對(duì)菌體活力的損傷[24]。在以過程DO為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料方式中，在保證供氧的情況下以溶氧濃度變化來判斷補(bǔ)料時(shí)機(jī)，雖全程碳源濃度相對(duì)較低，但基本可以滿足乳桿菌CHU-R生長需求，結(jié)合圖5顯著性差異分析，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葘?duì)乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程有較大影響，而且，在發(fā)酵過程中保持菌體處于半饑餓狀態(tài)，可以刺激乳桿菌CHU-R的生長和產(chǎn)物的積累，因而其可以充分利用發(fā)酵液中的碳源，使發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛鹊陀谄渌麅煞N補(bǔ)料工藝，既保證了原料的利用率，同時(shí)進(jìn)一步提高了乳桿菌CHU-R菌體量和蝦青素積累量，與桑美納等[25]通過補(bǔ)料方式將碳源濃度和溶解氧濃度同時(shí)控制在適中水平從而提高頭孢菌素C濃度效果方法一致。

乳桿菌CHU-R分批發(fā)酵及以過程pH為補(bǔ)糖依據(jù)、以總糖消耗為補(bǔ)料依據(jù)、以過程DO為補(bǔ)料依據(jù)的補(bǔ)料方式下，最佳的菌體生長和蝦青素合成情況如表1所示。

結(jié)果表明，相比分批發(fā)酵，3種補(bǔ)料工藝均能顯著提高乳桿菌CHU-R的菌體干重、蝦青素產(chǎn)量和細(xì)胞得率，其中，以過程DO為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料工藝能提高乳桿菌CHU-R生物量至2.6倍，蝦青素產(chǎn)量至2.8倍，但其對(duì)提高蝦青素細(xì)胞產(chǎn)率效果不顯著，原因可能是雖然通過提高每升發(fā)酵液中的乳桿菌CHU-R菌體量而提高了蝦青素總產(chǎn)量，但對(duì)于單菌的蝦青素積累量卻沒有顯著提高。關(guān)于如何進(jìn)一步提高單菌的蝦青素積累量，僅靠補(bǔ)料工藝難以達(dá)到理想的效果；因其涉及到蝦青素合成代謝途徑和代謝控制，若想顯著提高單菌的蝦青素積累量，需對(duì)乳桿菌CHU-R產(chǎn)蝦青素的機(jī)制進(jìn)行全面研究。

表1 乳桿菌CHU-R不同補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝結(jié)果Table 1 Lactobacillus CHU-R different fed-batch fermentation process results

3 結(jié)論

在本研究中，乳桿菌CHU-R作為蝦青素的生產(chǎn)菌株，在5 L反應(yīng)器中進(jìn)行分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵，其中補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式有3種，其補(bǔ)料依據(jù)分別是過程pH、總糖消耗和過程DO。經(jīng)過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)分批發(fā)酵對(duì)照組，本研究中采用的3種補(bǔ)料方式均可顯著提高植物乳桿菌CHU-R的生物量及其蝦青素積累量，其中以過程DO為補(bǔ)糖依據(jù)的補(bǔ)料分批發(fā)酵可達(dá)到最高，該發(fā)酵過程中的乳桿菌CHU-R生物量和蝦青素產(chǎn)量(最大值)分別是39.73 g/L和1.88 g/L，是分批發(fā)酵對(duì)照組的2.6和2.8倍，同時(shí)，該發(fā)酵全程保持著較高的溶氧量和較低卻足夠的糖濃度，有利于乳桿菌CHU-R生長和蝦青素積累。