邵婷婷，張敏,2,3,4*，劉威，姜雪，趙昱瑄，郝爽，厲建國，盧瑛

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海，201306) 4(食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306)

青椒果實由于其自身的高營養(yǎng)價值而深受廣大消費者的青睞。由于青椒果實原產(chǎn)于南美，是一種季節(jié)性較強(qiáng)的呼吸躍變型冷敏果蔬，采摘之后在常溫下不易貯藏，極易失水萎蔫、腐敗變質(zhì)，使其外觀品質(zhì)和貯藏性大大降低，因此青椒的貯藏保鮮就顯得尤為重要。目前人們大多數(shù)采用低溫貯藏的方式來延長其貯藏期限，但在低溫貯藏時，青椒果實由于其冷敏性的特點極易受到冷害而導(dǎo)致其可食用價值和商品價值大大降低，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中冷害是指高于0 ℃的低溫對產(chǎn)自于熱帶、亞熱帶的果實造成的生理代謝失調(diào)和組織傷害[1-2]。青椒果實的適宜貯藏溫度為(7～9) ℃[3-6]，當(dāng)青椒的貯藏溫度低于這個溫度范圍時就會出現(xiàn)冷害現(xiàn)象。由于冷害現(xiàn)象的發(fā)生，使得低溫運輸及貯藏受到了一定的限制。因此，需要找到適當(dāng)?shù)馁A前處理方式來解決這一問題。有關(guān)青椒果實的貯前處理方式常見的有化學(xué)保鮮劑處理、涂膜處理、天然提取物處理以及熱處理等方式[7]。其中熱激處理技術(shù)結(jié)合低溫貯藏的方式對保持果蔬品質(zhì)新鮮,延長貯藏期很有效，有著很好的應(yīng)用前景[8-17]。在常見的熱處理方式中，短時間的熱水浸泡處理被認(rèn)為是最有效的熱處理方式[18]。但目前關(guān)于同一有效熱水處理溫度下不同處理時間對青椒果實低溫貯藏期間的活性氧代謝及抗氧化系統(tǒng)的影響之間的研究還未有人涉及。本次試驗研究同一熱水處理溫度下不同的熱水處理時間對青椒果實的活性氧代謝和抗氧化物質(zhì)的變化情況，以期為青椒果實貯藏保鮮的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青椒：選用“洛椒”青椒作為試驗材料，于2018 年6月 4日采于上海市南匯新城鎮(zhèn)果園，裝于泡沫箱中當(dāng)天運回實驗室。

鹽酸羥胺、Na2HPO4、乙二胺四乙酸、對氨基苯磺酸、α-萘胺、DTT、三氯乙酸、二硫代硝基苯甲酸、還原性谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸(分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-100CA型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；H-2050R-1型高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)有限公司； THZ-82A型恒溫振蕩箱，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；BJ2100D型數(shù)字孔式電子天平，臺灣精達(dá)電子儀器有限公司；DDS-307型電導(dǎo)率儀，上海笛柏實驗設(shè)備有限公司；HSWX-600BS型電熱恒溫水溫箱，上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青椒預(yù)處理

挑選大小一致、形狀規(guī)整、果皮堅硬有光澤、無明顯機(jī)械損傷、無病蟲害的新鮮青椒果實裝于泡沫箱中當(dāng)天運回實驗室。果實平均長度為14～17 cm，平均質(zhì)量為60～90 g。將青椒果實清洗干凈后拭干備用。根據(jù)前期試驗結(jié)果，選取有效熱水處理溫度為44 ℃，來研究該溫度下處理青椒果實2、7、12、17和22 min，另外不經(jīng)過熱水處理的設(shè)為對照組，進(jìn)而研究不同的熱水處理時間對青椒果實的低溫貯藏期間細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝及抗氧化物質(zhì)的影響。將各組青椒果實處理后放于干凈的實驗臺上晾干再裝入厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋，最后放于(4±0.5) ℃相對濕度為(80±5)%的冷庫中貯藏，整個貯藏周期為21 d，每隔2 d取出青椒樣品觀察各組的冷害指數(shù)并測定其他各項品質(zhì)及生理生化指標(biāo)，重復(fù)3次。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)與測定方法

(1)冷害指數(shù)的測定

冷害指數(shù)是評價果蔬冷害程度很直觀的一個指標(biāo)。參照侯建設(shè)等[19]的方法來對青椒果實的冷害指數(shù)進(jìn)行評定。通過觀察青椒果實果面所呈現(xiàn)出的冷害面積將冷害癥狀分為4級。其中，0級：無冷害癥狀；1級：輕微冷害，冷害斑不超過果面的10%；2級：中度冷害，冷害斑占果面積的10%～40%；4級：嚴(yán)重冷害，冷害斑超過果面的40%。

(1)

(2)失重率的測定

在貯藏前用電子天平將每個新鮮青椒果實稱重并記為G0，將青椒從冷庫中取出后置于干凈的實驗臺上并用紙拭干，再用電子天平稱重并記為G。每組青椒稱重之后再將其放入新的厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋(打若干個1 cm的孔)中于冷庫中貯藏。用公式(2)計算出青椒的失重率。

(2)

(3)電解質(zhì)外滲率的測定

參考陳健華等[20-21]的測定方法，稍作修改，用DDS-307電導(dǎo)率儀測定。選取較為平整的青椒果面，用打孔器取10個圓片放入有編號的燒杯中，并添加20 mL去離子水后將燒杯放于轉(zhuǎn)速為150 r/min，環(huán)境溫度為25 ℃的恒溫振蕩箱(THZ-82A，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)內(nèi)振蕩10 min，振蕩后取出燒杯并用去離子水反復(fù)沖洗3次，用濾紙將青椒圓片表面的水分拭干，把圓片再次放入燒杯中，重新加入20 mL去離子水，測定此時的電導(dǎo)率值，并記為Ro。測定結(jié)束后把燒杯放于真空干燥器(規(guī)格：240 mm，上海帥登儀器有限公司)中60 min。之后取出燒杯再次放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩1 h，振蕩結(jié)束后取出測定此時的電導(dǎo)率并記為R。用保鮮膜覆于燒杯上并把燒杯于沸水中煮沸10 min，煮沸結(jié)束后靜待恢復(fù)至室溫，測定此時的電導(dǎo)率R′。記錄試驗結(jié)果，并用公式(3)來算出電導(dǎo)率。

(3)

(4)丙二醛含量的測定

MDA含量測定分光光度計分別測定450、532和600 nm的吸光值，并利用公式(4)計算測定青椒果實的MDA含量。

c/(μmol·L-1)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

(4)

(6)過氧化氫酶(CAT)活性的測定

CAT在催化H2O2分解成為水和分子氧的過程中，起到電子傳遞的作用，因此，可根據(jù)反應(yīng)過程中H2O2的消耗量來測定該酶的活性。H2O2在波長240 nm 處具有吸收峰，利用分光光度計可以檢測H2O2含量的變化。其中CAT活性測定以每克果肉1 min 內(nèi)OD240值變化0.01為1個酶活單位。

(7)谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測試

在還原型輔酶(NADPH)提供氫的條件下，GR能將氧化性谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，同時NADPH形成NADP+。NADPH在波長340 nm處具有吸收峰，因此可以通過測定OD340的減小來計算GR的活性。反應(yīng)系統(tǒng)中每分鐘OD340變化0.1為1個酶活性單位。

(8)還原型谷胱甘肽(GSH)的測定

谷胱甘肽是一種天然三肽，能和二硫代硝基苯甲酸產(chǎn)生一種黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長412 nm處具有最大光吸收，因此利用分光光度計法可測定青椒果實中GSH的含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理，SPSS 19.0 軟件繪圖進(jìn)行差異性分析。本文所有試驗為3次重復(fù)，試驗結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理條件對青椒果實冷害指數(shù)的影響

冷害指數(shù)是評價果蔬細(xì)胞冷害情況的一個很直觀、很重要的指標(biāo),可以直接反映出果蔬遭受低溫冷害的程度[23]。在青椒果實的整個低溫貯藏期間，由于青椒果實所處的環(huán)境溫度低于其冷害發(fā)生的臨界溫度[24]，所以隨著貯藏時間的延長，各組青椒果實的冷害癥狀就逐漸顯現(xiàn)，但不同處理組的青椒果實的冷害發(fā)生時間以及冷害程度又有所差別。由圖1可以看出，各組冷害發(fā)生時間先后順序為CK=22 min=17 min =7 min>2 min>12 min。

圖1 不同熱處理時間對青椒果實冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different heat treatment time on cold damage index of green pepper fruits

隨著貯藏時間的延長，各組青椒果實的冷害癥狀之間的差別就愈加明顯。貯藏到12 d時，44 ℃熱水處理12 min組青椒果實剛開始出現(xiàn)冷害癥狀，其值為12.5%，而2、7、17、22 min以及CK組的冷害指數(shù)分別為25%、43.8%、40.6%、41.7%和53.1%。在整個低溫貯藏期間，12 min處理組青椒果實的冷害指數(shù)一直都維持在較低水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他處理組，到貯藏結(jié)束時，12 min處理組青椒果實的冷害指數(shù)僅為對照組的36%。而其他各處理組青椒果實的冷害指數(shù)在貯藏后期都有大幅度的增加，其中 2、7、12、17、22 min和CK組青椒果實的冷害指數(shù)分別達(dá)到了37.5%、54.2%、59.4%、62.5%和68.9%，均顯著高于12 min組的冷害指數(shù)25%(P<0.05)?？赡苁且驗樵谫A藏初期的青椒果實冷害癥狀不是很明顯，隨著低溫貯藏時間的延長，各組青椒果實的冷害癥狀才隨之加劇，而12 min組青椒果實較低的冷害指數(shù)則說明該條件可以有效減輕青椒的冷害癥狀。

2.2 不同熱處理條件對青椒果實失重率的影響

新鮮的青椒果實果肉較厚且含水量較高，具有很好的外觀品質(zhì)以及很高的營養(yǎng)價值。但采摘后的青椒果實為了延長貯藏期常將其貯于低溫環(huán)境中。處于低溫環(huán)境下的青椒果實由于受到低溫逆境的傷害難免會出現(xiàn)失水皺縮、果皮變軟等現(xiàn)象。如圖2所示，隨著低溫貯藏時間的延長，由于不同熱水處理時間下的青椒果實都有一定程度的失水現(xiàn)象，所以青椒果實的失重率呈現(xiàn)出一直上升的趨勢，但不同處理組下青椒果實的失重率的上升情況差異也較明顯。

圖2 不同熱處理時間對青椒果實失重率的影響Fig.2 Effects of different heat treatment time on weight loss rate of green pepper fruits

在整個低溫貯藏期間，各個熱處理組青椒果實的失重率都始終低于對照組，但22 min處理和對照組青椒果實的失重率接近，二者之間無顯著性差異。第9天時，12 min組青椒果實的失重率僅為0.95%，而22 min組和CK組已經(jīng)分別達(dá)到了2.91%和3.07%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于12 min處理組。對于2、7和17 min處理組青椒果實的失重率來說，其數(shù)值也高于12 min處理組。該結(jié)果說明熱水處理時間較長或較短都不能很好達(dá)到抑制失重率增加的效果，12 min處理可以增強(qiáng)青椒果實在低溫貯藏期間的抗逆性，進(jìn)而抑制其失重率的大幅度增加，使青椒果實的失重率維持在較低的水平，有利于青椒果實的進(jìn)一步貯藏。

2.3 熱處理對電解質(zhì)外滲率的影響

采后的青椒果實在低溫貯藏時因為遭受了低溫逆境的傷害，其細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而造成青椒果實細(xì)胞膜的膜脂狀態(tài)發(fā)生改變，減弱了膜脂分離的流動性，改變了原生質(zhì)內(nèi)部的隔離狀態(tài)，使得青椒果實細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，從而導(dǎo)致果實軟化腐爛[25-26]。LYONS[27]研究得出果蔬細(xì)胞在處于低溫逆境中時，最先受到影響的就是生物細(xì)胞膜當(dāng)中的組成成分的狀態(tài)。因此，電解質(zhì)外滲率這一指標(biāo)其值越高，說明果蔬細(xì)胞的細(xì)胞膜受損害的程度就越嚴(yán)重[28]。由圖3可知，各處理組青椒果實的電解質(zhì)外滲率均隨著貯藏時間的延長而增加，這說明各組青椒果實細(xì)胞均受到了不同程度的傷害，膜脂狀態(tài)也發(fā)生了一定程度的改變，進(jìn)而體現(xiàn)在電解質(zhì)外滲率數(shù)值的變化。不同處理組青椒果實的電解質(zhì)外滲率增加的幅度不同，說明各處理組下的青椒果實對逆境的抗性不同。對于12 min處理組的青椒果實來說，其電解質(zhì)外滲率一直維持在一個較低的水平，說明該處理組下的青椒果實在低溫逆境下有了很好的抗性，進(jìn)而能夠保護(hù)細(xì)胞的膜脂狀態(tài)，減少細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的滲漏，維持了較低的電解質(zhì)外滲率值。在貯藏前期，其他各組青椒果實的電解質(zhì)外滲率都有一個明顯的上升過程，而12 min青椒果實的電解質(zhì)外滲率值僅增加了3%。12 min處理組青椒果實在21 d時其電解質(zhì)外滲率的數(shù)值僅為54%，是對照組青椒果實電解質(zhì)外滲率的78%。而22 min處理組青椒果實的電解質(zhì)外滲率在貯藏結(jié)束時甚至達(dá)到了70%，稍高于對照組青椒果實的電解質(zhì)外滲率。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是長時間的熱水處理使青椒果實細(xì)胞在應(yīng)對低溫逆境時的抗性減小。在整個低溫貯藏期間，12 min處理組的青椒果實的細(xì)胞膜完整性維持的最好，該處理組下的青椒果實的抗性高于其他各組(圖3)。

圖3 不同熱處理時間對青椒果實電解質(zhì)外滲率的影響Fig.3 Effect of different heat treatment time on electrolyte extravasation rate of green pepper fruit

2.4 熱處理對丙二醛(MDA)含量的影響

膜脂過氧化現(xiàn)象就是指細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)骨架磷脂分子被氧化，生成過氧化產(chǎn)物丙二醛，丙二醛的累積會破壞細(xì)胞膜的完整性[29]。由圖4可知，在貯藏前期，各處理組青椒果實的丙二醛含量均出現(xiàn)了一個輕微的下降過程，從第6天開始一直到低溫貯藏結(jié)束，各組青椒果實的丙二醛含量均持續(xù)增加，且不同處理組下的青椒果實丙二醛含量也呈現(xiàn)出來不同的增加幅度。各個處理組當(dāng)中，增加幅度最明顯的為對照組，其數(shù)值由貯藏初期的0.000 32 μmol/g增加到0.002 μmol/g。增加幅度最小的是12 min處理組，在貯藏結(jié)束時，其數(shù)值為0.001 μmol/g，明顯小于其他各處理組(P<0.05)。且在貯藏后期，各組青椒果實的丙二醛含量增加的幅度比前期要高，這可能是由于長期的處于低溫逆境中青椒果實內(nèi)的膜脂過氧化反應(yīng)加劇，使得丙二醛大量積累。青椒果實細(xì)胞內(nèi)的丙二醛含量的變化跟電解質(zhì)外滲率這一指標(biāo)之間有著一定的聯(lián)系。因為這兩種指標(biāo)的變化都跟青椒果實細(xì)胞的細(xì)胞膜膜脂狀態(tài)的改變有關(guān)。當(dāng)青椒果實處于低溫環(huán)境中時，其細(xì)胞膜的完整性受到破壞，加之細(xì)胞內(nèi)過氧化反應(yīng)的進(jìn)行，過氧化產(chǎn)物的積累使得青椒果實的抗逆性減弱。由結(jié)果可知，12 min熱水處理組使青椒果實的丙二醛含量維持在一個較低的水平，表明該處理條件下的青椒果實細(xì)胞內(nèi)的過氧化程度較低，細(xì)胞所受的逆境傷害最小。

圖4 不同熱處理時間對青椒果實MDA含量的影響Fig.4 Effect of different heat treatment time on MDA content of green pepper fruit

2.5 熱處理對超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

圖5 不同熱處理時間對青椒果實產(chǎn)生速率的影響Fig.5 Effect of different heat treatment time on production rate of green pepper fruit

2.6 熱處理對CAT活性的影響

CAT分解H2O2生成H2O和O2分子，能夠有效地清除自由基。不同熱水處理時間青椒果實的CAT酶活性的變化如圖6所示。

圖6 不同熱處理時間對青椒果實CAT活性的影響Fig.6 Effects of different heat treatment time on CAT activity of green pepper fruits

結(jié)果表明，CAT酶活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。由各組青椒果實在整個低溫貯藏期間CAT的活性變化可知，各組CAT活性均在第9天達(dá)到峰值，隨后則下降。各處理組青椒果實CAT活性的峰值分別為5.37、4.52、6.91、 5.25、5.24和4.58 U/(g·min)。由圖6可以看出，12 min處理組青椒果實的CAT活性一直高于其他各組，即使到了貯藏后期，12 min處理組青椒果實的CAT活性雖然有所降低，但降低的幅度卻維持在較低的水平，貯藏到第21天時，12 min處理組青椒果實的CAT活性仍然高達(dá)4.21 U/(g·min)，為對照組的1.91倍。CAT酶活性的變化趨勢反映了青椒果實細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除水平。12 min組青椒果實的CAT活性一直高于其他處理組，說明該處理條件下的青椒果實的活性氧代謝維持在較低的水平，細(xì)胞受活性氧物質(zhì)的傷害程度最小。因此，12 min處理下的青椒果實清除活性氧的能力處在一個較高的水平，提高了青椒果實在低溫期間對逆境的抗性，增加了細(xì)胞的自我保護(hù)能力。

2.7 熱處理對谷胱甘肽還原酶活性的影響

圖7 不同熱處理時間對青椒果實GR活性的影響Fig.7 Effects of different heat treatment time on GR activity of green pepper fruits

12 min處理組青椒果實的GR活性一直高于其他各組。在第9天時各組青椒果實的GR均達(dá)到峰值，其中12 min處理組青椒果實的GR活性高達(dá)29.85 U/mg，其他各組青椒果實的GR活性除了17 min組的為21.75 U/mg外，其他各組均低于20 U/mg。各組青椒果實的GR活性不僅是峰值大小的差別，即使在貯藏結(jié)束時，12 min處理組青椒的GR活性仍然較高，維持在15.64 U/mg，是對照組的2.72倍。青椒果實在低溫貯藏期間由于受到低溫逆境的影響，其細(xì)胞內(nèi)會發(fā)生一系列的活性氧代謝，此時青椒果實細(xì)胞中的GR就會保持一種較高的活性來應(yīng)對，由上述結(jié)果可知，12 min處理組的青椒果實的GR的活性較高，對青椒細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧起到了很好的清除作用，降低了青椒果實低溫貯藏期間的逆境傷害，是一種很好的熱處理條件。

2.8 熱處理對還原型谷胱甘肽含量的影響

圖8 不同熱處理時間對青椒果實GSH含量的影響Fig.8 Effects of different heat treatment time on GSH content of green pepper fruits

3 結(jié)論