趙雪婷，彭珍，胡敏，黃濤，熊濤*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047) 2(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330031)

益生菌是攝入足量后對宿主的健康有益的活的微生物[1]，乳酸菌屬和雙歧桿菌屬是最常使用的益生菌屬[2]，是國際公認(rèn)的食品級安全微生物[3]。乳酸菌可通過改善腸道菌群的平衡，促進(jìn)良好的消化，提高免疫力，降低膽固醇，減輕乳糖不耐受等，發(fā)揮其益生功能[4]。干酪乳桿菌屬于乳酸菌屬，廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和人的口腔、腸道內(nèi)含物、糞便等中。作為一種益生菌，干酪乳桿菌因其營養(yǎng)價值和保健作用越來越受到關(guān)注，相關(guān)研究逐年增多。分離自人體糞便的L.caseiShirota在提高腸道健康、調(diào)節(jié)人體免疫力、預(yù)防腫瘤、預(yù)防肺炎、抗敏性等方面已有大量研究，我國自行分離、鑒定并擁有相關(guān)專利的L.caseiZhang和L.caseiBL23 的益生功能也在不斷的探索和驗證中[5]。同時，干酪乳桿菌作為一種工業(yè)微生物菌株，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中[6]，L.caseiShirota發(fā)酵的Yakult乳飲料已經(jīng)被全世界廣泛接受。

FAO/WHO認(rèn)定益生菌的標(biāo)準(zhǔn)，須滿足3個基本特點：耐受胃腸黏膜的環(huán)境，黏附宿主的腸壁細(xì)胞，分泌物或者分解產(chǎn)物為抗菌物質(zhì)[7]。而耐藥性問題是乳酸菌應(yīng)用安全方面的首要問題[8-9]。因此，為了更好地開發(fā)及利用南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保藏的3株干酪乳桿菌，本研究通過對這幾株干酪乳桿菌的耐高鹽、耐酸、耐膽鹽、自凝聚性、疏水性、黏附性、抑菌性及抗生素耐藥性進(jìn)行測定，為菌株在后期的健康食品和功能食品中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人源干酪乳桿菌NCU011056、NCU011057、NCU011 061，單核增生李斯特菌CMCC 54007、金黃色葡萄球菌CMCC 26003、大腸埃希氏菌CMCC 44496、沙門氏菌CMCC 50041，由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保藏提供。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、牛肉膏10、葡萄糖30、無水乙酸鈉5、酵母膏5、檸檬酸三胺2、K2HPO42、MgSO40.2、吐溫-80 1，pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

DMEM完全培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液、10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%青-鏈霉素、1%非必需氨基酸。

DMEM培養(yǎng)液、1×PBS緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、優(yōu)級胎牛血清：賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司；牛膽鹽、青-鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液：北京索萊寶科技有限公司；二甲苯：天津大茂化學(xué)試劑廠；抗生素：溫州市康泰生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DWS-DG250厭氧工作站，華粵行儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，長沙長錦科技有限公司； DNP-9272型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Thermo-ST16高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾(中國)科技有限公司；37XC倒置生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器進(jìn)出口有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株耐酸耐膽鹽性能測定

在普通MRS液體培養(yǎng)基中加入NaCl，使其質(zhì)量濃度分別為50、100 g/L；用稀HCl調(diào)整普通MRS液體培養(yǎng)基使其pH分別為3.0、2.0；在普通MRS液體培養(yǎng)基中加入牛膽鹽，使其質(zhì)量濃度分別為3、5 g/L；同時以普通MRS作為對照；將3株干酪乳桿菌株活化后，接種于上述不同MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 孵育，于0和4 h取樣，稀釋至合適梯度后涂布，培養(yǎng)48 h后平板活菌菌落計數(shù)，按公式(1)計算存活率[10]：

(1)

1.3.2 菌株自凝聚性能測定

將過夜培養(yǎng)的菌株離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，用生理鹽水調(diào)整菌株菌液濃度至108CFU/mL。在37 ℃孵育24 h。在第0、3、6和24 h時，取菌懸液上層，于600 nm下測定吸光度(At)，每次測定3個平行。按照公式(2)計算細(xì)菌的自凝聚率[11]：

(2)

式中:A0表示0 h時刻菌體初始吸光值；At代表t時刻菌懸液上層的吸光值。

1.3.3 菌株表面疏水性能測定

將過夜培養(yǎng)的菌株離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，用生理鹽水調(diào)整菌株菌液濃度至108CFU/mL。取2 mL調(diào)好濃度的菌懸液與2 mL二甲苯混合，漩渦振蕩10 min，靜置30 min。取水相在600 nm下測定A值，每次測定3個平行。按照公式(3)計算細(xì)菌的疏水性[12]：

(3)

式中:A0和A分別表示與二甲苯混勻前后水相在600 nm下測量所得的吸光值。

1.3.4 菌株對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞系黏附性能測定

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的CaCo-2細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，之后用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為105cells/mL，裝于6孔組織培養(yǎng)板中，每孔2 mL，于5% CO2、95%空氣培養(yǎng)箱中37 ℃孵育至細(xì)胞長至單層。棄去組織培養(yǎng)板中各孔的DMEM營養(yǎng)液，用無菌PBS緩沖液洗板2遍，其中1個孔用0.4 mL胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化后，加入0.6 mL PBS，用巴氏吸管吹打，將細(xì)胞完全消化下來并使之混合均勻，血球計數(shù)板計算細(xì)胞濃度。其他5孔加入1 mL DMEM不完全培養(yǎng)液和1 mL菌懸液(108CFU/mL)，混合均勻，于培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育2 h。孵育后棄去組織培養(yǎng)板中各孔的混合液，用無菌PBS緩沖液洗滌5次，以除去未黏附的菌體。加入0.4 mL胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化后加入0.6 mL無菌PBS緩沖液，進(jìn)行梯度稀釋，涂布于MRS固體平板上計算黏附的細(xì)菌數(shù)[12]，如公式(4)：

(4)

1.3.5 菌株抑菌性能測定

采用牛津杯法[13]測定3株菌株的無細(xì)胞上清液對常見病原菌的抑制能力來評價菌株的抑菌性能。選取由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保藏提供的單核增生李斯特菌CMCC 54007、金黃色葡萄球菌CMCC 26003、大腸埃希氏菌CMCC 44496和沙門氏菌CMCC 50041作為指示菌均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中，將牛津杯放置于培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)24 h的3株干酪乳桿菌菌懸液離心取上清，每個牛津杯中加入200 μL上清液，37 ℃放置12 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.6 菌株抗生素耐藥性評價測定

采用K-B(藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法)進(jìn)行藥敏試驗來評價菌株的抗生素耐藥性。取無菌生理鹽水稀釋后濃度為1.0×109CFU/mL的菌懸液0.1 mL，均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，放置30 min以上。待干燥后，將紙片平貼在涂好細(xì)菌的瓊脂表面。所用的藥敏紙片分別為：青霉素G(10 μg)、阿莫西林(10 μg)、頭孢曲松(30 μg)、諾氟沙星(10 μg)、環(huán)丙沙星(5 μg)、 萬古霉素(30 μg)、替考拉寧(30 μg)、慶大霉素(10 μg)、卡那霉素(30 μg)、四環(huán)素(30 μg)、紅霉素(15 μg)、利福平(5 μg)。貼好藥物紙片的平板放置30 min以上，然后倒置平板37 ℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈大小[11]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.0將所得的實驗數(shù)據(jù)繪制成圖；使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株模擬胃腸道耐受性能

菌株的耐高鹽能力對菌株在胃腸道中的生存以及其在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用等有重要意義，高鹽環(huán)境容易造成菌體細(xì)胞脫水、質(zhì)壁分離，從而導(dǎo)致菌體代謝被抑制，甚至導(dǎo)致菌體死亡[14]。圖1顯示，在50 g/L質(zhì)量濃度鹽環(huán)境中孵育4 h后，3株菌的活菌數(shù)基本保持不變，在 100 g/L高質(zhì)量濃度鹽環(huán)境中孵育4 h后，存活率均約為95%。

菌株能在pH 3.0條件下存活是衡量其耐酸性的標(biāo)準(zhǔn)之一[15]，為進(jìn)一步模擬胃酸的情況，本實驗同時測定了pH 2.0條件下菌株的耐受情況。在pH 3.0下孵育4 h后，3株干酪乳桿菌的存活率都高達(dá)97%以上，且NCU011056活菌數(shù)有正增長，在pH 2.0條件下孵育4 h后，3株菌的存活率都在84%以上。

菌株經(jīng)過胃的消化后到達(dá)小腸，人體小腸中膽鹽質(zhì)量濃度一般為0.3～3 g/L[16]，為進(jìn)一步測定菌株對膽鹽耐受性，本研究同時對菌株在3和5 g/L膽鹽下3株菌的存活情況進(jìn)行了實驗。3株干酪乳桿菌在3 g/L膽鹽下孵育4 h后存活率均在70%以上，且NCU011056的存活率高達(dá)86.10%，隨著膽鹽濃度的增加，耐受性下降，在5 g/L膽汁鹽下，NCU011055的存活率降至50.12%，而NCU011056存活率仍然保持在80%。

本研究中3株干酪乳桿菌都是從嬰兒糞便中篩選的，經(jīng)過了胃和腸道的消化到大腸，這可能是其對高鹽、酸和膽鹽具有高耐受性的原因。

圖1 三株干酪乳桿菌在不同環(huán)境中處理4 h后的存活情況Fig.1 Survival of the three strains of Lactobacillus casei treated with various conditions for 4 h

2.2 菌株自凝聚性能

研究表明，菌株的自凝聚有助于腸道定植，并對生物膜的形成有重要影響，自凝聚性能較強(qiáng)的菌株能夠在腸道細(xì)胞表面形成一層天然的屏障防止食源性致病菌定殖于腸道表面[17]。3株干酪乳桿菌菌株的自聚性能的實驗結(jié)果如表1所示。3株菌株懸液的自凝聚率都隨孵育時間的延長而增大，24 h后都在70%以上，其中干酪乳桿菌NCU011056自聚率相對最高，為83.81%。MONTORO等[18]提出，細(xì)菌的自凝聚能力可分為：低(16%～35%)，中等(35%～50%)和高(50%以上)。由此可見，這3株干酪乳桿菌的自凝聚能力均處于較高水平。

表1 三株干酪乳桿菌菌株自凝聚情況Table 1 Co-aggregation of the three strains of Lactobacillus casei

2.3 菌株表面疏水性能

疏水性是細(xì)菌與腸道表皮細(xì)胞相互吸附的重要指標(biāo)之一，細(xì)菌表面疏水性作為乳酸菌的表面特性，被用于間接評估益生菌的黏附能力[19]，DEL等[20]提出40%疏水性是益生菌菌株的基本要求的最小值，3株菌株的表面疏水性能測試結(jié)果如表2所示。干酪乳桿菌NCU011057對二甲苯的疏水率為86.21%，其他2株干酪乳桿菌的疏水率都在95%以上，遠(yuǎn)高于RIAZ等[21]從母乳中篩選的7株乳酸菌的疏水率(33%～69%)，這表明了這3株干酪乳桿菌對二甲苯都表現(xiàn)出了高度的疏水性。

表2 三株干酪乳桿菌菌株表面疏水性及 對Caco-2細(xì)胞系黏附情況Table 2 Surface hydrophobicity of three strains of Lactobacillus casei and adhesion to Caco-2 cell line

注：同列不同字母表示差異顯著。下同。

2.4 菌株對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞系黏附性能

高黏附的菌株能夠在動物腸道中停留相對較長的時間，有利于菌群在腸道內(nèi)長久定植，競爭致病菌黏附位點，鞏固腸黏液屏障，維持腸道健康[22]。Caco-2細(xì)胞系是分離自人結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞株，以表皮吸附的方式生長，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可以表現(xiàn)出成熟腸道所具有的特征，采用Caco-2單層細(xì)胞更能模擬體內(nèi)腸道黏附[23]。3株干酪乳桿菌對Caco-2細(xì)胞系黏附情況如表2所示。3株干酪乳桿菌的黏附能力具有明顯差異，NCU011056較其他菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的黏附能力，黏附指數(shù)為60.08%，且遠(yuǎn)高于DAS等[24]研究的3株干酪乳桿菌的黏附指數(shù)(32%～45%)，NCU011057的黏附能力相對最弱，為14.52%，但也高于趙圣明等[25]研究的6株乳酸菌的黏附率(其中最高為13.57%)。

2.5 菌株抑菌性能

乳酸菌抑制致病菌的生長，有助于胃腸道菌群的微生態(tài)環(huán)境健康[26]。3株干酪乳桿菌發(fā)酵液對指示菌的抑菌作用如表3所示。3株干酪乳桿菌對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性指示菌均表現(xiàn)出了抑菌活性，對單核增生李斯特菌和沙門氏菌的抑菌能力相對較強(qiáng)；其中，與其他2株干酪乳桿菌相比，NCU011056對4株指示菌的抑菌直徑均相對較大，顯示了較強(qiáng)的抑菌能力。

表3 三株干酪乳桿菌的抑菌情況Table 3 Antibacterial activity of the three strains of Lactobacillus casei

2.6 菌株抗生素耐藥性評價

通過對菌株進(jìn)行藥敏性測定，可避免耐藥性對菌株應(yīng)用安全方面的影響。3株干酪乳桿菌通過引用CHARTERIS等[27]提供的抑菌圈直徑評判標(biāo)準(zhǔn)，測定的藥敏性能結(jié)果如表4所示。表4顯示了3株測試菌株具有類似的抗生素敏感性，這可能與該3株干酪乳桿菌來源于同一個6個月母乳喂養(yǎng)的嬰兒的糞便有關(guān)。這3株干酪乳桿菌對青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、利福平抗生素均敏感，對環(huán)丙沙星均中度敏感，對萬古霉素、替考拉寧、慶大霉素、卡那霉素等抗生素均具有抗性，這種抗性與很多報道[24,28]相似：很多乳酸菌對萬古霉素、替考拉寧先天具有抗性，且這種耐藥性一般不會轉(zhuǎn)移傳遞給致病菌[28]。

表4 三株干酪乳桿菌對不同抗生素敏感性情況Table 4 Sensitivity of the three strains of Lactobacillus casei to antibiotics

3 結(jié)論

益生菌不斷被應(yīng)用于健康食品和功能食品中[29]，對提高食品安全性、豐富營養(yǎng)成分、賦予產(chǎn)品功能特性和改善產(chǎn)品風(fēng)味等起到重要作用[30]。本研究對南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保藏的3株干酪乳桿菌耐受性、黏附性、抑菌性及抗生素耐藥性進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，3株干酪乳桿菌對高鹽、酸和膽鹽環(huán)境具有高耐受性，自凝聚率24 h后都在70%以上，對二甲苯的疏水率都在86%以上，對Caco-2細(xì)胞系的黏附率為14.52%～60.28%(其中NCU011056的黏附率為60.28%)，對4種常見的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌都有抑制能力，對青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、利福平均敏感，對環(huán)丙沙星均中度敏感。綜上所述，3株人源干酪乳桿菌，尤其是NCU011056，是十分有潛力的優(yōu)良益生菌株。后期可將這3株干酪乳桿菌進(jìn)行動物實驗來評價其具體益生性能，并可考慮應(yīng)用于發(fā)酵奶制品、果蔬等食品，或制成益生菌菌劑應(yīng)用于保健品等行業(yè)中。