董軍 楊曉 刁攀 梁寶寶 蔡璇 王旭斌 賀西京*

上頸椎融合術是治療寰樞關節(jié)不穩(wěn)的一種重要的手術方法[1]。按手術入路的不同可分為經口咽入路融合術和經后路融合術兩種。由于椎體融合使得原有椎體節(jié)段運動功能喪失，融合術被認為是加速鄰近節(jié)段退變的重要因素之一。頸椎鄰近節(jié)段退變是指出現(xiàn)的鄰近于融合節(jié)段的頸椎疾病，通常表現(xiàn)為頸部疼痛、上肢或手部感覺過敏或減退、椎間隙變窄、骨贅形成等一系列臨床癥狀或影像學變化[2-3]。鄰近節(jié)段退變的確切病因目前尚缺乏統(tǒng)一認識，對于該疾病的研究多集中在生物力學上。目前發(fā)現(xiàn)，融合后的頸椎的運動功能在融合節(jié)段上消失但重新分布于鄰近的椎間隙內。在鄰近節(jié)段退變的諸多變化中，椎間隙變窄為該疾病較早的改變，其實質為椎間盤的退變，其內的一系列膠原蛋白的含量和分布隨之發(fā)生變化。椎間盤內的膠原纖維通過膠原蛋白肽鏈形成具有特定的三維空間結構，進而使得椎間盤具有高度的抗張強度和韌性。椎間盤退變時具有顯著變化特征的為Ⅰ型膠原蛋白的變化。纖維環(huán)具有多層、有序排列的同軸心薄層結構，其內Ⅰ型膠原蛋白有序分布[4]，Ⅰ型膠原蛋白主要分布于纖維環(huán)的外層，且其含量由外向內逐漸遞減[5]。隨著年齡的增長、椎間盤退變的進行，Ⅰ型膠原蛋白在纖維環(huán)內的表達逐漸增加，髓核內也出現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白[6-7]。這種膠原含量及分布的改變使得椎間盤內的空間結構發(fā)生改變，導致其承受能力降低，在臨床上表現(xiàn)出纖維環(huán)破裂、髓核脫出。

寰樞關節(jié)為頸椎中旋轉功能最大的解剖結構，其旋轉功能約占整個頸椎的50%[8]。寰樞關節(jié)融合后，其原有的旋轉功能將由下頸椎代償。為了解上述生物力學的改變能否加速鄰近節(jié)段退變，筆者試圖通過直接觀察頸椎間盤內Ⅰ型膠原蛋白的分布變化來了解對鄰近節(jié)段退變所造成的影響。鑒于犬的寰樞關節(jié)和人的寰樞關節(jié)在解剖結構上極為相似且同樣具備靈活的旋轉功能，為進一步了解上頸椎融合術對鄰近節(jié)段的影響，本實驗通過建立犬的上頸椎融合模型觀察C2-3椎間盤內Ⅰ型膠原蛋白的變化，初步了解上頸椎融合術對鄰近椎間盤的影響。

1 材料與方法

本實驗是在嚴格遵守本院醫(yī)學倫理委員會要求的條件下完成的。

1.1 主要儀器

寰樞融合鋼板6 具，本實驗中所用寰樞關節(jié)融合鋼板為本課題組自行設計的一款專用于犬的“工”字型鈦合金假體（西北有色金屬研究院加工）（見圖1A）。該假體厚度為2 mm，在實驗中根據具體犬的寰齒關節(jié)形態(tài)預折彎為與之相適應的形狀。含4 個直徑在3.5 mm 左右的螺釘孔（見圖1B）。

圖1 上頸椎融合鈦板、術中照片和術后即刻X 線：A.上頸椎融合板；B.術中安放于C1-2 的融合鈦板；C.術后即刻正位X 線；D.術后即刻側位X 線

1.2 手術方法

1.2.1 動物分組

成年健康雄性家犬12 只（由西安交通大學第二附屬醫(yī)院外科動物中心提供），平均體重：（23.0±0.5）kg。均禁食24 h、禁飲12 h 以排空胃腸道，并經后肢體表靜脈建立靜脈通道。每只犬予以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，經靜脈通道注射麻醉，待犬出現(xiàn)呼吸淺慢、角膜反射遲鈍、舌外伸時，為麻醉適宜表現(xiàn)。若出現(xiàn)呼吸抑制，立即給予腎上腺素2 mL、尼可剎米0.375 mg 靜脈推注，輔助擠壓胸廓輔助呼吸搶救。全麻生效后，行X 線檢查排除實驗以檢查患寰樞關節(jié)有無異常。明確無異常后將12 只犬隨機分為實驗組和對照組，每組各6 只。

1.2.2 模型建立

手術過程：將上述全麻生效的實驗組犬肌注青霉素鈉（320 U/只），并行頸前區(qū)備皮。備負壓吸引器2 臺，分別用于術區(qū)清潔和術中呼吸道分泌物的清除。取犬仰臥位，并將犬頸部向前反曲，充分暴露咽以下頸部，稀釋碘伏反復消毒咽部后鋪置無菌巾單。以正中手術切口，逐層切開咽后壁，充分顯露寰椎前結節(jié)、前弓、側塊和樞椎椎體。根據上述解剖形態(tài)，將“工”形融合板用折彎器預折呈所需形態(tài)。用直徑為3.0 mm 鉆頭分別在寰椎側塊和樞椎關節(jié)突下鉆孔，并用測深測量孔的深度，選取適宜長度螺釘，依次擰入4 枚螺釘(見圖1B)。待徹底止血后，逐層縫合肌層、黏膜層、皮膚切口。為防止頸部水腫造成器官壓迫，術后不予環(huán)形石膏固定而以前后條形石膏托固定。對照組不進行手術處理。

術后護理：術后犬能自行站立并走動認為麻醉完全蘇醒，可輔以飲水及流質食物。各組犬分籠飼養(yǎng)，每籠1 只，術后肌注青霉素（80 萬單位）3 d，預防感染；并注意保暖，每天更換1 次敷料。控制室溫在18 ～20℃；實驗動物能夠在籠內自由活動。

影像學觀察：術后立即拍攝頸椎正、側位X 線片。觀察人工關節(jié)假體有無松動、脫釘、斷裂。

材料獲取與保存：于術后3 個月，通過注射大劑量戊巴比妥鈉處死實驗組和對照組犬。解剖頸椎獲取C2-3椎間盤并立即放入4%多聚甲醛溶液（10%福爾馬林）中固定至24 h，然后用于免疫熒光染色的部分轉移至20%蔗糖溶液中脫水過夜，用濾紙吸干多余水分置入凍存管放入液氮罐中保存?zhèn)浔鶅銮衅褂?。其余椎間盤用于HE 染色固定。

1.2.3 HE 染色

將上述保存在4%多聚甲醛里的組織塊進行固定至72 h后，以濃度20%～90%乙醇作脫水劑，由低到高逐漸脫去上述組織塊中的水分。置于二甲苯中透明，并以石蠟包埋，切成厚度為5 ～8 m 厚的薄皮。將切片放入伊紅-蘇木精染色液（HE）中染色2 ～3 min，在共聚焦顯微鏡下攝片。依據椎間盤退變組織學評分表（見表1）[9]，將上述HE 染色的椎間盤進行評分。

表1 椎間盤退變組織學評分系統(tǒng)

1.2.4 免疫熒光染色

將保存在液氮罐內的C2-3椎間盤取出，置于室溫下恢復溫度，包埋于固定架上，用鋒利刀片在-10℃下進行均勻切片，厚度為8 m；在室溫下將原放置于濕盒內的冰凍切片吹干；用PBS 緩沖液在室溫下振洗2 次，每次5 min；將上述切片用0.1%胰蛋白酶在37℃恒溫箱下孵育10 min，進行抗原修復；在室溫下，再用PBS 緩沖液振蕩清洗2 次，每次5 min；滴加一抗(Collagen-Ⅰ-antibody，ABCAM 公司，編號：ab23446)(稀釋度1∶200），切片過夜孵育后于室溫下，用PBS 緩沖液清洗2 次，每次5 min；滴加二抗(FITC標記的山羊抗小鼠IgG 抗體，南京凱基生物科技有限公司，編號：KGAA)(稀釋度1∶50)。孵育封片后置于熒光顯微鏡下觀察。將在同一曝光時間(75 ms)，發(fā)射波長為495 nm條件下進行攝片，得到免疫熒光圖像，隨機選取并記錄5 個視野。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件將圖像轉換為灰度圖像，并進行光密度測量，獲得每個椎間盤的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學處理。將光密度結果以均值±標準差表示，并進行雙側獨立樣本 檢驗。對組織學評分采用Mann-Whitney U 秩和檢驗。＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗組術后均能正常飲食，未見傷口感染，術后肢體功能未見明顯異常。術后3 個月兩組犬均行大劑量戊巴比妥鈉靜脈注射安樂死。

2.1 X 線檢查

術后X 線檢查提示假體固定于C1和C2椎體，4 枚螺釘分別置于寰椎側塊或樞椎關節(jié)突下方。未見鋼板斷裂、螺釘脫出等（見圖1C、圖1D）。

2.2 C2-3 椎間盤HE 染色

HE 染色發(fā)現(xiàn)實驗組犬C2-3椎間盤纖維環(huán)結構紊亂，膠原纖維束間裂隙增大，髓核減少。對照組犬C2-3椎間盤纖維環(huán)結構呈有序環(huán)狀分布，排列整齊、規(guī)則、縱橫交錯、大小及方向一致，無團塊樣結構出現(xiàn)。實驗組椎間盤組織學評分平均為1.5 分，對照組椎間組織學評分平均為0.5 分（=3.105，＜0.05）（見圖2）。

圖2 犬C2-3 椎間盤外觀照片及HE 染色圖片：A.實驗組椎間盤外觀照片；B.對照組椎間盤外觀照片；C.實驗組C2-3 椎間盤HE 染色（×100）；D.實驗組C2-3 椎間盤HE 染色（×100）；E.實驗組和對照組椎間盤評分，*表示＜0.05

2.3 C2-3 椎間盤免疫熒光染色

免疫熒光染色圖發(fā)現(xiàn)正常組犬C2-3椎間盤內膠原纖維排列整齊，膠原走行清楚，膠原纖維環(huán)與髓核之間的過渡區(qū)較寬，纖維環(huán)呈同心圓排列規(guī)則整齊，實驗組犬C2-3椎間盤纖維環(huán)中增生的膠原纖維排列紊亂，纖維環(huán)排列不規(guī)整，腫脹明顯并呈結節(jié)樣團狀結構，出現(xiàn)裂隙及斷裂(見圖3A、圖3B)。經分析發(fā)現(xiàn)實驗組犬C2-3椎間盤Ⅰ型膠原蛋白較對照組增加（見表2），實驗組C2-3椎間盤光密度為（391 052.98±18 869.81），對照組C2-3椎間盤光密度為（312 945.42±22 400.47），經雙側檢驗發(fā)現(xiàn)，兩組光密度值差異有統(tǒng)計學意義（=6.532，＜0.001）（見圖3C）。

表2 實驗組、對照組犬C2-3 椎間盤免疫熒光圖像光密度

圖3 免疫熒光染色圖片：A.實驗組C2-3 椎間盤內Ⅰ型膠原蛋白（白色箭頭）（×200）；B.對照組C2-3 椎間盤內Ⅰ型膠原蛋白（白色箭頭）（×200）；C.實驗組和對照組C2-3 椎間盤光密度值，**表示＜0.001

3 討論

上頸椎融合術是治療上頸椎骨折、不穩(wěn)等的主要術式[1]。隨著該術式在臨床的應用，其安全性和有效性已經得到廣泛證實，但在融合后C1-2旋轉功能大大喪失是該術式不可避免的問題之一。近年來，融合后鄰近節(jié)段退變這一問題受到越來越多的關注。目前對于該疾病的病因尚缺乏統(tǒng)一認識，對于鄰近節(jié)段退變的研究多集中在生物力學研究上。研究發(fā)現(xiàn)，融合后頸椎的運動功能在融合節(jié)段上消失但重新分布于鄰近的椎間隙內[10]。上述變化的直接結果使得鄰近節(jié)段的運動范圍較原有的增大且伴隨著鄰近椎間盤和關節(jié)突關節(jié)內的壓力增加。

椎間盤是高度特異性的軟骨性組織[11]，由骨性終板、軟骨終板、外層纖維環(huán)和內層髓核組成。它是脊柱吸收震蕩、減緩沖擊，為脊柱提供穩(wěn)定性并保持脊柱一定活動范圍的重要結構。纖維環(huán)的大體形態(tài)呈同心圓狀排列，纖維環(huán)所含的膠原蛋白在每一層均有序排列。作為椎間盤的主要組成部分，膠原蛋白占纖維環(huán)干重的50%～70%，占髓核干重的15%～20%[12-13]。纖維環(huán)是非均一的韌性組織，主要由Ⅰ型膠原蛋白和蛋白聚糖組成；髓核是均一的凝膠狀組織，主要由蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白組成[14]。

Nerlich 等[15]證實椎間盤內存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ型膠原蛋白。其中I 型膠原蛋白形態(tài)粗大，集中分布于纖維環(huán)的周邊，具有較強的抗拉伸性能，為抵抗鄰近椎體過度運動提供良好的支持作用。上述多種膠原蛋白互相交聯(lián)形成具有特定三維結構的膠原交聯(lián)，該結構是維持椎間盤生物力學性能和結構框架的重要因素之一，尤其是膠原交聯(lián)的種類和程度決定了膠原的機械性能[15]。膠原含量和種類的差異進一步導致蛋白多糖、水等細胞外基質合成與降解失衡，最終使得椎間盤不同區(qū)域承受負荷和應力的能力不同，進而使得椎間盤損傷的機會增加，表現(xiàn)為纖維環(huán)破裂、髓核突出等。但究其本質而言，椎間盤的退變過程即為其內原有正常膠原纖維空間結構改變的過程。呂振華、西永明等[6-7]通過核酸分子原位雜交技術觀察Ⅰ型膠原蛋白在人椎間盤的表達規(guī)律，認為伴隨年齡的增長、椎間盤退變的進行，Ⅰ型膠原蛋白在纖維環(huán)內的表達逐漸增加。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組椎間盤內Ⅰ型膠原表達顯著高于對照組，提示寰樞椎融合術能加速鄰近C2-3椎間盤的退變。

理論上，對于脊柱融合術鄰近節(jié)段的退變在組織學水平上的出現(xiàn)要較影像學上更早。而文獻上報道組織學鄰融合節(jié)段的C2-3椎間盤出現(xiàn)顯著性差異至少在半年以上，本研究中實驗組犬C2-3椎間盤在術后3 個月后Ⅰ型膠原蛋白的顯著增加，提示上頸椎融合術更早加速C2-3椎間盤的退變。

本實驗有如下局限性，僅建立了動物模型而未進一步觀察接受上頸椎融合術后患者鄰近椎間盤的核磁共振信號變化，以便更好了解C2-3椎間盤在人體內的動態(tài)變化過程。僅對一種膠原蛋白即Ⅰ型膠原蛋白進行了間接定性觀察，缺乏深入的定量研究。