劉 何，周 瑩，常雪艷，杜 爽，辛 艷

（天津市種子管理站，天津 300061）

天津黃瓜育種產(chǎn)業(yè)作為中國蔬菜種子產(chǎn)業(yè)典型代表之一，育成品種在全國占有率名列前茅。目前，品種套牌現(xiàn)象較為突出，由于自身特點(diǎn)所限，栽培型黃瓜與同科的南瓜、甜瓜相比，種質(zhì)資源遺傳背景相對(duì)狹窄，品種鑒定對(duì)檢驗(yàn)人員要求高。國際黃瓜全基因組測序項(xiàng)目的完成[1]給利用SNP標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定奠定了重要基礎(chǔ)。本文對(duì)前期選擇的田間綜合表現(xiàn)良好的津優(yōu)系列黃瓜雜交種及品種F19等材料，嘗試通過基因組重測序篩選出高質(zhì)量SNP并結(jié)合KASP分型驗(yàn)證，確定SNP用于參試品種鑒定的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試品種由天津科潤黃瓜研究所提供，為華北生態(tài)型F1雜交品種：津優(yōu)1號(hào)（JY1）、津優(yōu)315號(hào)（JY315）、津優(yōu)335（JY335）、津優(yōu)358號(hào)（JY358）、津優(yōu)401（JY401）、津優(yōu)406（JY406）、津優(yōu)409（JY409）、津優(yōu)365（JY365）、F19、津優(yōu)800（JY800）和津冬科潤99（J99）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間種植 設(shè)置行距1.2～1.4 m，株距25～28 cm，單株栽植，每行25～30株。參試品種隨機(jī)區(qū)組排列，2個(gè)重復(fù)。對(duì)照為津優(yōu)35號(hào)（JY35）。栽培管理同常規(guī)，不施化肥和生長激素。5月底結(jié)瓜期品種特征性狀表現(xiàn)明顯期進(jìn)行觀察，根據(jù)NY∕T 2235-2012《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南》，調(diào)查品種中10株的主要性狀。

1.2.2 基因組重測序和SNP驗(yàn)證 基因組DNA提取采用種子直播，恒溫25 ℃溫度條件下發(fā)芽，參考葛鳳偉等[2]CTAB提取方法混合提取15株單株DNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測A260/280和1%瓊脂糖電泳質(zhì)量檢測后，按1～5 μg（約100 ng·μL-1）分裝由諾禾致源科技公司高通量測序。重測序采用品種樣本混池測序，采用Illumina HiSeq X10平臺(tái)，雙端讀長（Paired-end reads）150 bp，測序深度10X。

原始測序數(shù)據(jù)先通過原始測序質(zhì)控，得到初步的有效讀長（Clean reads）。數(shù)據(jù)使用FastA/Q[3]軟件再次過濾接頭序列；同時(shí)去除過濾后整條讀長平均堿基質(zhì)量低于Q20的序列；去除過濾后序列長度小于50 bp的序列。通過短序列比對(duì)軟件Bio-Bwa[4]將過濾后有效讀長比對(duì)到參考基因組[5-6]。使用SAMtools[7]對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，再利用Picard[7]去除測序中PCR生成的冗余讀長。

在比對(duì)到參考基因組序列基礎(chǔ)上，通過基因數(shù)據(jù)變異檢測工具軟件Genome Analysis Toolkit[8]從中提取全基因組的潛在多態(tài)性SNPs。對(duì)原始變異VCF記錄文件中SNPs進(jìn)行篩選，設(shè)置條件為：（1）樣本無重要缺失信息；（2）變異質(zhì)量值VQ≥50；（3）基因型質(zhì)量值GQ≥30；（4）核基因組測序深度DP為5～100X（細(xì)胞器基因組DP＞10X）；（5）在樣本之間存在多態(tài)性；（6）雜合型變異位點(diǎn)MAF等位基因頻率0.25～0.5。對(duì)挑選出的高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，使用Minimal marker挑選出可區(qū)分參試品種的SNPs組合，最后選取10個(gè)在5’和3’側(cè)翼序列50 bp內(nèi)無過濾過變異的候選位點(diǎn)用于擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 降落PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃變性3 mins；94 ℃變性20 s，65 ℃退火1 min（每循環(huán)降低0.8 ℃），10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火1 min，28個(gè)循環(huán)；20 ℃讀取信號(hào)。使用ABI Q6 Flex熒光定量PCR儀進(jìn)行SNP分型，并確定基因分型和重測序結(jié)果一致性。擴(kuò)增體系（表1）的引物（表2）采用Primer3在線工具[9]。

表1 PCR體系組分

表2 KASP分型引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 田間種植比較

調(diào)查苗期和結(jié)瓜期21個(gè)性狀和1個(gè)可選性狀（白粉病抗性），其中僅第1雌花節(jié)位、雌花比、瓜把和瓜條長度、果均重、果皮花紋、黃線、白粉病抗性存在部分差異且多數(shù)性狀為群體觀測性狀；其他的性狀表現(xiàn)均相同或極近似（表3）。

表3 參試品種部分性狀調(diào)查結(jié)果

SPSS分析表明KMO分值低于0.6（表4），表明選擇的性狀間相關(guān)性低，不適合降維分析。綜合參試津優(yōu)系列品種主要性狀特點(diǎn)為：成株心形五角葉；瓜條棒狀深綠色、直順，瓜把較短，刺瘤中等，刺毛白色較多；果肉厚，單瓜重200 g以上，有明顯清香味；抗白粉病等常見病害。由于品種田間表型相似程度高，要求調(diào)查人員對(duì)這些品種特征特性表現(xiàn)要非常熟悉，否則正確區(qū)分難度較大。

表4 KMO取樣適當(dāng)性測試和巴特利特球形檢驗(yàn)法

2.2 樣品DNA提取結(jié)果

圖1 CTAB法提取基因組DNA

所提取的DNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳觀察，DNA降解少，條帶整齊（圖1）。檢測A260/280比值為1.7～2.0（表5），DNA質(zhì)量滿足要求。A，B:液氮冷凍磨碎葉片；C:樣品DNA質(zhì)量使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，M2為BM15000 DNA Marker；泳道1～11分別為：JY1，JY335，JY315，JY358，JY365，JY401，JY406，JY409，JY800，J99，F(xiàn)19。

表5 樣本DNA濃度檢測

2.3 重測序和SNP位點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果

測序共產(chǎn)生約47.28 Gb原始數(shù)據(jù)（每樣品平均約4.3 Mb原始數(shù)據(jù)），JY315讀長數(shù)據(jù)最少。最終獲得有效數(shù)據(jù)（表6），其中參試品種60%以上的讀長均可正確比對(duì)到參考基因組（黃瓜L9930參考基因組大小約367 Mb[6]）接近196 Mb序列（表7）。

表6 最終獲得有效數(shù)據(jù)

表7 序列比對(duì)結(jié)果

過濾流程從684 891個(gè)變異中篩選出381個(gè)變異，180個(gè)（166個(gè)SNPs，14個(gè)InDels）位于核染色體上。使用Minimal marker對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行三位點(diǎn)組合選擇，挑選出可區(qū)分參試品種的25個(gè)SNPs，35種三位點(diǎn)組合，涉及1～6號(hào)染色體。最終確定的7個(gè)SNP分型結(jié)果（圖2）與二代測序結(jié)果吻合，可用于參試品種區(qū)分：第2號(hào)組合（Chr1_14433374，Chr3_24329128，Chr5_26188907）和第32號(hào)組合（Chr3_33307511，Chr5_1548305，Chr5_6143567），以及Chr3_328 23086（表8）。

圖2 7個(gè)SNP有效位點(diǎn)基因分型結(jié)果

表8 7個(gè)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增和測序分型結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用樣本材料的全基因組重測序?qū)NP位點(diǎn)進(jìn)行挖掘，最終利用KASP基因分型7個(gè)位點(diǎn)變異進(jìn)行了驗(yàn)證，并可達(dá)到對(duì)參試品種鑒定的初步目的。參試品種為黃瓜雜交種小樣本集合，品種生態(tài)型相同，田間種植表型極為近似。SNP基因分型材料通常選擇遺傳背景差異大且為近交純和體（自交株系），便于基因組單體型分析。對(duì)于遺傳背景高度雜合的參試品種的SNP挖掘和良好基因分型難度較大，實(shí)際檢測中有25個(gè)三位點(diǎn)組合的非重復(fù)位點(diǎn)位于1～6號(hào)染色體，最終確認(rèn)的7個(gè)SNP位點(diǎn)也未達(dá)到染色體均勻分布，完全匹配測序的變異位點(diǎn)數(shù)目過低，可能與參試材料來源和生態(tài)型有關(guān)。本試驗(yàn)通過最終確定的SNP位點(diǎn)可以對(duì)建立的小樣本集合進(jìn)行鑒定，但未能達(dá)到在每染色體建立2～3個(gè)代表性位點(diǎn)，后續(xù)可通過擴(kuò)展樣本來源，增加位點(diǎn)覆蓋有效性。

另外，在測序建庫時(shí)由于條件所限，采用單株混合DNA提取，對(duì)于F1雜交種測序也可能帶來結(jié)果誤差，有待利用其他材料進(jìn)一步評(píng)估。