衣振偉，劉曉鳳，王光強，熊智強，艾連中，夏永軍

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093）

牛樟芝（Antrodia camphorata）是20世紀(jì)90年代在我國臺灣發(fā)現(xiàn)的珍稀藥用真菌，專一寄生于臺灣特有的保護樹種牛樟樹（Cinnamomum kanehirai）腐朽樹干內(nèi)壁，生長極為緩慢（1年～3年），自然產(chǎn)量稀少，其主要培養(yǎng)方式如圖1所示[1,2]。近年來，許多學(xué)者研究顯示牛樟芝具有多種功能活性，含有豐富的次級代謝產(chǎn)物，包括三萜類化合物、泛醌類化合物、Antrodins類化合物、超氧歧化酶、多糖等[3-7]。牛樟芝不同培養(yǎng)方式獲得的產(chǎn)物有較大差異。子實體中含有豐富的三萜類化合物，尤其是具有24(28)-en側(cè)鏈特征的麥角甾烷類三萜；而菌絲體中含有的主要活性成為泛醌類化合物Antroquinonols以及馬來酸衍生物Antrodins[8]。其中以Antrquinonol為代表的泛醌類組分是極具應(yīng)用潛力的活性化合物。本文從牛樟芝泛醌類組分活性、生物及化學(xué)合成等角度對其進行綜述。

圖1 不同培養(yǎng)方式得到的牛樟芝Fig.1 Antrodia camphorata obtained by different culture methods

1 牛樟芝泛醌類組分的發(fā)現(xiàn)

2007年，Lee等[9]人將固態(tài)發(fā)酵樟芝磨成粉末后用正己烷進行萃取，從中得到Antroquinonol，是牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中鑒定出的第一個泛醌類化合物，分子式為C24H38O4，微黃色，屬于脂溶性苯醌，結(jié)構(gòu)上與輔酶Q3相近。Yang等[10]從牛樟芝固態(tài)發(fā)酵粉末中分離出4-acetyl-Antroquinonol-B和Antroquinonol-B，皆為無色油脂化合物，分子 式 分 別 為C26H38O7及C24H36O6，Antroquinonol及Antroquinonol-B結(jié)構(gòu)式相差一個五碳環(huán)，Antroquinonol-B及4-acetyl-Antroquinonol-B結(jié)構(gòu)式相差一個乙酰基（acetyl）。Antroquinonol-D也是從牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，與Antroquinonol相差一個甲氧基[11]。研究結(jié)果表明牛樟芝泛醌類化合物具有顯著的抗腫瘤、抗炎等生理活性，開發(fā)價值較大，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 牛樟芝菌絲體中的泛醌類化合物Fig.2 Ubiquinone compounds in the mycelium of Antrodia camphorata

2 牛樟芝泛醌類活性成分功能研究

2.1 抗癌活性

研究表明泛醌類組分能夠抑制多種癌細(xì)胞的增殖和遷移，目前已有文獻報道包括Hep3B、HepG2、MCF-7、MDA-MB-231、DU-145、LNCaP 等。Antroquinonol能夠下調(diào)Bcl2蛋白的表達，從而降低與之相連的P13K和mTOR蛋白水平，促進NSCLC細(xì)胞凋亡[12]。通過抑制P13K/AKT/β-catenin信號通路，Antroquinonol能夠抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵染[13]。Lin等[14]研究證明，Antroquinonol能夠抑制兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT15和LoVo的增殖，兩者的G150值分別為34.8 μM和17.9 μM。此外，該研究還顯示Antroquinonol能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移且呈劑量依賴性。Lee等[15]人也有類似的發(fā)現(xiàn)，Antroquinonol能夠在不影響細(xì)胞活力的情況下對乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移具有預(yù)防作用，低濃度（2.5～10 μM）的Antroquinonol顯著降低了乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231的侵襲和遷移（50%～80%）。

4-acetyl-Antroquinonol-B 作用于肝癌細(xì)胞HepG2， 其 1C50 為 0.1 μg·mL-1，能夠調(diào) 節(jié) p53、p21以及p27蛋白水平，有效抑制mTOR磷酸化，降低VEGF表達量以及RhoGTPases活性，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移，此外還具有抗酒精性肝損傷作用[16-19]。

2.2 抗炎活性

炎癥，是機體損傷的一種防御反應(yīng)，也是每天都會出現(xiàn)在人類生活中的一種復(fù)雜的生理反應(yīng)，通常表現(xiàn)為發(fā)紅、腫脹和疼痛。研究發(fā)現(xiàn)，它與許多病理條件包括糖尿病、關(guān)節(jié)炎、心血管疾病有關(guān)。

Chang等[20]人發(fā)現(xiàn)，Antroquinonol具有良好的降低細(xì)胞氧化脅迫作用的活性，可以穿過血腦屏障，在阿爾茨海默病小鼠模型實驗中，能夠有效提高學(xué)習(xí)和記憶能力，降低大腦β-淀粉樣物水平，減少星形細(xì)胞增生程度。Antroquinonol也具有良好的抗炎活性，能夠有效地對抗節(jié)段硬化性腎小球腎炎（FSGS）以及通過腹腔注射沙門氏菌型LPS誘導(dǎo)的嚴(yán)重紅斑狼瘡腎炎，通過激活Nrf2抗氧化通路、抑制T細(xì)胞和NLRP3炎性體，顯著改善蛋白尿癥狀，從而緩解嚴(yán)重的1gA腎炎[21,22]。4-acetyl-Antroquinonol和Antroquinonol-B能強烈的抑制巨噬細(xì)胞生成NO，其 1C50 分別為 16.2 μg·L-1和 14.7 μg·L-1[23]。

2.3 保肝活性

長期的酒精攝入會引起肝臟疾病，大量科學(xué)文獻顯示過量酒精攝入會增加肝中酶類、細(xì)胞因子和趨化因子比如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用，這些都在酒精誘發(fā)的肝臟疾病的發(fā)病機理和進程中有重要作用[24]。另外飲酒會導(dǎo)致體內(nèi)自由基過量產(chǎn)生，接著導(dǎo)致肝臟中還原型谷胱甘肽（GSH）含量水平的自然損耗[25]。

Kumar等[26]證明了從牛樟芝菌絲體醇提取物中得到的Antroquinonol能通過Nrf-2激活作用保護肝細(xì)胞免受乙醇誘發(fā)的氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)Antroquinonol能顯著抑制由酒精誘發(fā)的AST、ALT、ROS、NO、MDA產(chǎn)量和人類肝癌HepG2細(xì)胞中GSH損耗。蛋白印跡和RT-PCR分析顯示Antroquinonol能通過MAPK途徑增強Nrf-2激活和下調(diào)抗氧化基因HO-1。本研究表明了Antroquinonol通過一種涉及Nrf-2激活作用和向上調(diào)控MAP激酶蛋白介導(dǎo)的下游抗氧化基因表達的機制來實現(xiàn)對肝細(xì)胞免受乙醇誘發(fā)的氧化應(yīng)激的保護作用。在活體內(nèi)喂食牛樟芝菌絲體醇提取物也得到了相似結(jié)果。結(jié)果表明Antroquinonol在酒精性肝病方面有治療價值。

2.4 其他活性

牛樟芝泛醌類活性成分除了在抗癌、抗炎、保肝方面表現(xiàn)突出，據(jù)科研人員近年來探究發(fā)現(xiàn)其在抗氧化、抑制腫瘤、增強免疫力等方面也具有顯著的效果。

Guan等[27]人研究了Antroquinonol作為抗氧化劑和抑制炎癥反應(yīng)，評估其對CD8+T細(xì)胞的免疫抑制作用和對色素沉著的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，Antroquinonol可以抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，減少CD8+T細(xì)胞浸潤和促炎性細(xì)胞因子分泌，并在體外抑制細(xì)胞因子1L-2和1FN-γ以及T細(xì)胞活化標(biāo)記物CD69和CD137的產(chǎn)生，以抵抗H2O2誘導(dǎo)生成的脫色素。

Antroquinonol能夠降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6抗凋亡蛋白含量，同時提高促凋亡蛋白合成，進一步研究顯示，Antroquinonol的氫鍵與粘著斑激酶（FAK）的86位Arg殘基結(jié)合，抑制其酶活從而抑制腫瘤形成[28]。

Yu等[29]證明了Antroquinonol通過順序信號級聯(lián)誘導(dǎo)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的抗癌活性。 它誘導(dǎo)P13-kinase/Akt活性受到抑制，進而阻斷mTOR/p70S6K/4E-BP1信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白和Cdks的下調(diào)，翻譯抑制造成細(xì)胞周期G1停滯和線粒體依賴性細(xì)胞凋亡。上調(diào)的K-ras也可能通過與Bcl-xL的結(jié)合促成細(xì)胞凋亡。此外，自噬細(xì)胞死亡和加速衰老也至少部分地解釋了AsPC-1細(xì)胞中的Antroquinonol介導(dǎo)的抗癌作用。

3 牛樟芝泛醌類組分生物合成研究進展

3.1 泛醌類組分的一般合成途徑及其關(guān)鍵酶

3.1.1 泛醌生物合成途徑

泛醌是一類脂溶性醌類化合物，側(cè)鏈由不同數(shù)目（6～10）異戊二烯單位組成，在各類生物代謝中具有廣泛的功效。從泛醌的結(jié)構(gòu)上來看，它的生物合成（圖3）前體是4-羥基苯甲酸。細(xì)菌通過酶消除分支酸的丙酮酸部分來合成，而植物和動物由苯丙氨酸或酪氨酸經(jīng)4-羥基苯丙烯酸中間體來合成。4-羥基苯甲酸酚羥基在輔酶Q2（CoQ2）的作用下，與一個適當(dāng)長度的焦磷酸聚異戊二烯酯反應(yīng)，在其鄰位發(fā)生C-烷基化，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可進一步被修飾，如羥基化、O-甲基化、脫羧等，這些反應(yīng)在真核生物和原核生物中不同；其中，Ubi1、輔酶Q6（CoQ6）和輔酶Q7（CoQ7）的作用是催化途徑中三個單加氧酶反應(yīng)，而輔酶Q5（CoQ5）的作用則是催化泛醌和甲基萘醌二者合成途徑的甲基化反應(yīng)。

圖3 泛醌類化合物的生物合成途徑Fig.3 Biosynthesis pathway of ubiquinone compounds

3.1.2 泛醌生物合成途徑中關(guān)鍵酶

參與泛醌生物合成的酶類數(shù)量多，且催化反應(yīng)種類多，這就給代謝調(diào)控的研究帶來了諸多困難。

1）輔酶 Q2（CoQ2）

輔酶Q2（CoQ2），4-羥基苯甲酸聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶，是參與CoQ生物合成，將聚丙烯酰側(cè)鏈連接到4-羥甲苯甲酸酯環(huán)，產(chǎn)生膜結(jié)合的第一泛醌中間體。研究表明，該基因的突變將導(dǎo)致CoQ10缺陷，進而阻礙了線粒體氧化作用中的電子傳遞鏈[30]；該基因的突變還會導(dǎo)致致命性嬰兒多系統(tǒng)疾病[31]。

2）輔酶 Q3（CoQ3）

輔酶Q3（CoQ3），O-甲基轉(zhuǎn)移酶，催化泛醌生物合成的兩個甲基化步驟。CoQ3第一次甲基化發(fā)生在途徑內(nèi)的不同位置，因此涉及不同的底物，并歸類為聚異戊二烯基二羥基苯甲酸酯甲基轉(zhuǎn)移酶和2-聚異戊二烯基-6-羥基苯酚甲基化酶，第二次甲基化時這兩種酶是共同的，被歸類為3-脫甲基柏木醇-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。Poon等[32]研究證明人類CoQ3酶可以恢復(fù)CoQ3缺失酵母突變體的泛醌-6的生物合成；Jonassen等[33]研究證實了來自酵母和大鼠的酶也分別催化3-脫甲基柏木醇-6和3-脫甲基柏木醇-9的甲基化。

3）輔酶 Q5（CoQ5）

輔酶Q5（CoQ5），2-甲氧基-6-聚異戊二烯基-1,4-苯并喹啉甲基化酶，參與泛醌生物合成的甲基化步驟，是泛醌生物合成途徑中的C-甲基轉(zhuǎn)移酶，Dibrov等[34]研究表明將來自釀酒酵母的CoQ5基因?qū)氪竽c桿菌后，它能夠補充UbiE突變體的呼吸缺陷。

4）輔酶 Q6（CoQ6）

輔酶Q6，單加氧酶，是泛醌生物合成所必需的進化上保守的單加氧酶，負(fù)責(zé)泛醌的醌環(huán)C5-羥基化。Heeringa等[35]研究發(fā)現(xiàn)CoQ6的突變引發(fā)腎病綜合癥并伴有神經(jīng)性耳聾，在小鼠和斑馬魚中的敲除CoQ6基因?qū)е录?xì)胞凋亡增加而生長減少。

5）輔酶 Q7（CoQ7）

輔酶Q7，5-脫甲氧基泛醌羥化酶，負(fù)責(zé)泛醌生物合成中5-脫甲氧基泛醌在5-羥基泛醌中的羥基化。研究顯示該基因突變與壽命延長有關(guān)[36-37]；Felkai S等[38]研究發(fā)現(xiàn)該基因缺陷減緩各種發(fā)育和生理過程，包括細(xì)胞周期，胚胎發(fā)生，胚胎后生長，節(jié)律行為和衰老。

6）UbiD

UbiD，3-辛二?；?4-羥基苯甲酸羧基裂解酶，是催化3-辛烯基-4-羥基苯甲酸向2-辛二烯基苯酚轉(zhuǎn)化途徑的酶。UbiD對于合成泛醌是至關(guān)重要的。大腸桿菌ubiD突變體會使Q8生物合成產(chǎn)生缺陷，累積4-羥基-3-辛?；郊姿幔℉P8B），且降低脫羧酶活性[39]。

3.2 牛樟芝泛醌類組分合成途徑探索

牛樟芝泛醌類組分其化學(xué)結(jié)構(gòu)與CoQ非常相似，具有類似的母核以及異戊二烯側(cè)鏈，在液態(tài)發(fā)酵中添加CoQ0、對羥基苯甲酸、香葉醇等前體物能夠有效地誘導(dǎo)牛樟芝合成Antroquinonol，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，添加CoQ0 能上調(diào)S-腺苷蛋氨酸合成酶的表達，為Antroquinonol 合成提供甲基[40]。4-acetyl-Antroquinonol的合成途徑也與CoQ的合成相關(guān)，通過添加對羥基苯甲酸、CoQ0等醌環(huán)前體，能夠誘導(dǎo)其合成。通過在發(fā)酵中添加13C同位素標(biāo)記的油酸，結(jié)果顯示Antroquinonol和4-acetyl-Antroquinonol-B的醌環(huán)上有13C檢出，牛樟芝泛醌類組分可能由苷色酸作為醌環(huán)前體，利用聚酮體合成途徑合成[41]。此外，牛樟芝風(fēng)味成分2,4,5-trimethoxybenzaldehyde和橙花叔醇能夠有效地誘導(dǎo)4-acetyl-Antroquinonol-B合成[42]。

牛樟芝遺傳背景及重要活性成分合成途徑的研究非常薄弱，部分學(xué)者對其菌體生長過程中一些調(diào)控酶基因以及涉及子實體化的基因進行了研究[43-44]。研究表明CoQ0的轉(zhuǎn)化率較低，說明轉(zhuǎn)化過程中存在限速步驟，影響泛醌類組分產(chǎn)量的進一步提高。但是目前對牛樟芝泛醌類組分的合成途徑研究較為欠缺。對于牛樟芝菌絲體而言，深入研究牛樟芝遺傳體系，利用不同組學(xué)技術(shù)研究自身活性成分（Antroquinonols、Antrodins等）的合成機制，用以提高產(chǎn)量，是非常重要的。

泛醌類組分，包括Antroquinonol、Antroquinonol B和4-acetyl-Antroquinonol B等，在常規(guī)液態(tài)發(fā)酵中是不能合成的，周璇等[45]通過在其中添加前體物CoQ0誘導(dǎo)牛樟芝菌絲體合成Antroquinonol；隨后，在同步萃取發(fā)酵時添加植物油，不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生了Antroquinonol，還獲得了較多Antroquinonol B。固態(tài)發(fā)酵菌絲體中可以合成泛醌類物質(zhì)，然而，牛樟芝菌絲體較為脆弱，在固態(tài)發(fā)酵過程中不能進行攪拌，否則菌絲斷裂會嚴(yán)重抑制菌體生長和代謝。因此，固態(tài)發(fā)酵的傳至和傳熱會受到嚴(yán)重影響，進而限制固態(tài)發(fā)酵的容器大小和規(guī)模，生產(chǎn)效率較低。

4 牛樟芝泛醌類活性成分化學(xué)合成研究進展

4.1 Antroquinonol的短時間化學(xué)合成

Antroquinonol化學(xué)合成法的研究主要開始于近兩年，2015年Hsu等[46]人提出了一種簡單的合成Antroquinonol的方法，利用2,3,4-三甲氧基苯酚經(jīng)過七步合成Antroquinonol，大大簡化了Antroquinonol化學(xué)合成的步驟。

Antroquinonol具有獨特的核心結(jié)構(gòu)4-羥基-2,3-二甲氧基環(huán)己-2-烯酮，其帶有4，5 -順式- 5，6 -反式構(gòu)型的甲基、法尼基和羥基取代基。Antroquinonol的短時間合成由2,3,4-三甲氧基苯酚分七步完成，首先在甲醇中氧化成富含2,3,4,4-四甲氧基環(huán)己二烯酮的高電子基質(zhì)，然后作為關(guān)鍵步驟與二甲基醚進行Michael反應(yīng)，隨后進行烷基化、還原和差向異構(gòu)化，在3個連續(xù)的立體中心處加入所需的取代基。

4.2 Antroquinonol D的化學(xué)全合成

2014年Sulake等[47]人通過4 -甲氧基苯酚實現(xiàn)了Antroquinol D的全合成。此外，研究了二甲氧基環(huán)己二烯酮的邁克爾加成。主要步驟涉及螯合和基質(zhì)控制環(huán)己酮的非對映體選擇性還原和內(nèi)酯化。內(nèi)酯合成促進了酮的非對映選擇性還原，合成中的其他關(guān)鍵反應(yīng)包括丙二酸二甲酯在環(huán)己二烯酮上的邁克爾加成，二羥基化和Wittig烯化。

2015年Sulake等[48；49]人又對樟芝泛醌類活性成分的全化學(xué)合成方法進行了相關(guān)的報道,描述了Antroquinonol和Antroquinonol D的第一次全合成。該路線的特征是銥催化的烯烴異構(gòu)化-克萊森重排反應(yīng)（1CR），內(nèi)酯化和Grubbs烯烴復(fù)分解。通過硒化/氧化方案和消除β-甲氧基來實現(xiàn)所需的α, β-不飽和度，以提供來自共同中間體的兩種天然產(chǎn)物。

5 存在問題及展望

本文綜述了近年來以Antroquinonol為代表的牛樟芝中泛醌類活性成分的研究，發(fā)現(xiàn)了其擁有的生物活性比如保肝、抗炎及抗癌活性等，為開發(fā)出治療人類疾病的有效藥物奠定了基礎(chǔ)。

由于牛樟芝的珍稀及泛醌類物質(zhì)的微少產(chǎn)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類的大量需求，因此，促進牛樟芝生長和泛醌類物質(zhì)合成的研究刻不容緩。泛醌類組分的合成主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種方式。其中關(guān)于化學(xué)合成法的研究主要開始于近兩年，但是現(xiàn)有的Antroquinonol類化學(xué)合成方法的步驟復(fù)雜、總收率低以及產(chǎn)品純度低，很難實現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn)。

通過微生物發(fā)酵的牛樟芝菌絲體培養(yǎng)物與子實體特征活性成分雖然相差較大，但是其特有的泛醌類化合物以及Antrodins類等化合物有效地補充了菌絲體產(chǎn)物的不足，更重要的是菌絲體培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此，我們應(yīng)著力于微生物調(diào)控，實現(xiàn)泛醌類活性成分的大量獲得。