雷萍 張文雋 吳亞召 王磊 趙玉鵬 任宏飛

摘要? ? 試驗(yàn)以香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1等4個(gè)品種為研究材料，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性。結(jié)果表明，4個(gè)香菇品種之間的遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.669 5～0.878 7;UPGMA法聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)品種分為2組，香菇LB-21與香菇B15-1親緣關(guān)系較近，遺傳相似性系數(shù)為0.874 5，香菇L808與香菇215親緣關(guān)系較近，遺傳相似性系數(shù)為0.878 7。

關(guān)鍵詞? ? 香菇;AFLP分子標(biāo)記;遺傳多樣性;聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S646.12? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A? ? ? ? 文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）09-0047-02

Abstract? ? The genetic diversity of LB-21，L808，215 and B15-1 Lentinus edodes varieties was analyzed by AFLP molecular marker.The results showed that the variation range of genetic similarity coefficient among the four Lentinus edodes varieties was 0.669 5-0.878 7.UPGMA clustering analysis showed that the four varieties were divided into two groups，LB-21 and B15-1 were closely related，and the genetic similarity coefficient was 0.874 5. L808 and 215 were closely related，and the genetic similarity coefficient was 0.878 7.

Key words? ? Lentinus edode;AFLP molecular marker;genetic diversity;clustering analysis

香菇（Lentinus edodes（Berk.）sing）又名香蕈、冬菇、花菇、椎茸等，在分類(lèi)學(xué)上隸屬于擔(dān)子亞門(mén)層菌綱傘菌目側(cè)耳科香菇屬[1]。其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值較高，是世界第二大食用菌，也是世界真菌學(xué)家研究的熱點(diǎn)。我國(guó)香菇栽培歷史悠久，栽培面積逐年增加，菌種選育和栽培技術(shù)研究等工作受到了科研工作者的重視。香菇菌種是香菇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要基礎(chǔ)，決定了其產(chǎn)量和質(zhì)量。從分子生物學(xué)水平鑒定菌種和構(gòu)建DNA指紋圖譜有助于準(zhǔn)確識(shí)別菌種，從而有效地利用不同香菇品種的優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)香菇生產(chǎn)的發(fā)展[2]。

目前，應(yīng)用于香菇種質(zhì)資源研究的分子標(biāo)記主要有SSR、AFLP、RAPD、SCAR、SRAP[3-7]。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)具有模板量少、引物通用性高、多態(tài)檢出率高、穩(wěn)定性和重復(fù)性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物分子遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域[8-9]。本試驗(yàn)利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析不同香菇品種的遺傳多樣性，從基因水平反應(yīng)品種之間的關(guān)系，為進(jìn)一步開(kāi)展香菇生物學(xué)研究提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

供試香菇品種共4個(gè)，即香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1，均來(lái)自陜西省微生物研究所微生物菌種資源中心第三研究室。香菇LB-21是選育品種，抗霉菌能力強(qiáng)、產(chǎn)量高，經(jīng)小面積栽培產(chǎn)量穩(wěn)定;香菇L808是廣溫型品種，菇體中等偏大、菇形圓整、菇柄較短、菇質(zhì)優(yōu)、菌齡短，產(chǎn)量高;香菇215是中高溫型品種，菌肉厚實(shí)，菌柄中長(zhǎng)偏短，抗逆性強(qiáng)，產(chǎn)量高;香菇B15-1是野生香菇菌株，抗雜菌污染能力強(qiáng)，柄短肉厚。

1.2? ? 主要試劑及引物

主要試劑有Taq酶（2 U/μL）、dNTP（10 mmol/L）、引物（10 mmol/L）（生工基因）、內(nèi)切酶（10 U/μL）（NEB公司）、T4連接酶（5 U/μL）（NEB公司）。Marker為DL2000、100 bp DNA Ladder。引物在北京六合華大基因科技有限公司合成。試驗(yàn)所用接頭和引物信息見(jiàn)表1，試驗(yàn)所用引物組合見(jiàn)表2。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 樣品DNA提取。采用改良CTAB法進(jìn)行DNA提取，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2? ? 限制性?xún)?nèi)切及連接。對(duì)所選樣品采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，酶切與連接反應(yīng)同步進(jìn)行。酶切與連接體系（20 μL）為：10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL，AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL，EcoR I Adaptor 1 μL（10 μmol/L），Mse I Adaptor 1 μL（10 μmol/L），模板DNA 5 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。酶切-連接反應(yīng)條件為25 ℃、5 h，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.3? ? 預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，E00 1 μL（20 μmol/L），M00 1 μL（20 μmol/L），酶切-連接模板DNA 4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4? ? 選擇性擴(kuò)增。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，Eprimer 1 μL（20 μmol/L），Mprimer 1 μL（20 μmol/L），模板DNA 5 μL（預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍），加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性35 s，65 ℃復(fù)性35 s（每循環(huán)降低0.7 ℃），72 ℃延伸1 min，12個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，23個(gè)循環(huán)。

1.3.5? ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析。選擇擴(kuò)增PCR產(chǎn)物和上樣緩沖液比例8∶3，旋渦混勻，94 ℃變性10 min后，于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析，銀染后觀(guān)察。利用Quantity One軟件對(duì)4個(gè)樣品、12對(duì)引物組合擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)無(wú)帶和有帶情況轉(zhuǎn)化為0和1數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYSpc 2.11軟件包進(jìn)行個(gè)體相似系數(shù)計(jì)算，并采用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，利用popgene和NTSYS軟件對(duì)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 聚丙烯酰胺凝膠分析

利用12對(duì)隨機(jī)引物組合對(duì)4個(gè)香菇品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度介于100～500 bp之間，條帶清晰。擴(kuò)增電泳圖譜見(jiàn)圖1。

擴(kuò)增條帶總數(shù)為239條，其中多態(tài)性條帶為100條;引物組合P5擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最多，多態(tài)百分比為65.38%;引物組合P9擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)百分比為15.38%。

2.2? ? 品種多態(tài)性分析

由表3可知，香菇LB-21擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為180條，其中多態(tài)性條帶41條，多態(tài)比率最低，為22.78%，特有條帶2條;香菇L808、香菇215分別擴(kuò)增出195、188條，多態(tài)性條帶分別為52、49條，其中特有條帶分別為12、2條;香菇B15-1擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為196條，多態(tài)性條帶57條，多態(tài)比率最高，為29.08%，含特有條帶7條。

2.3? ? 遺傳相似性系數(shù)分析

由表4可知，4個(gè)香菇品種之間的遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.669 5～0.878 7。香菇LB-21與香菇L808、香菇215之間的遺傳性系數(shù)較小，說(shuō)明遺傳距離較遠(yuǎn);與香菇B15-1之間的遺傳相似性系數(shù)較高，為0.874 5。香菇L808與香菇215之間的遺傳相似性系數(shù)較高，為0.878 7;與香菇B15-1之間的遺傳性系數(shù)較小，說(shuō)明遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.4? ? 聚類(lèi)分析

采用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到4個(gè)香菇品種的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。從圖2可以看出，4個(gè)香菇品種被分為了2組，其中香菇LB-21與香菇B15-1為一組，說(shuō)明這2個(gè)品種親緣關(guān)系相對(duì)較近，遺傳相似性系數(shù)為0.874 5;香菇L808與香菇215為一組，兩者親緣關(guān)系較近，遺傳相似性系數(shù)為0.878 7。

3? ? 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用12對(duì)隨機(jī)引物組合擴(kuò)增4個(gè)香菇品種基因組DNA，香菇B15-1擴(kuò)增條帶總數(shù)為196條，多態(tài)性條帶57條，多態(tài)比率最高（29.08%），含有特有條帶7條

香菇L808、香菇215擴(kuò)增條帶總數(shù)分別為195、188條，多態(tài)性條帶分別為52、49條，其中特有條帶分別為12、2條;香菇LB-21擴(kuò)增條帶總數(shù)為180條，其中多態(tài)性條帶41條，多態(tài)比率最低（22.78%），特有條帶2條。

4個(gè)香菇品種之間的遺傳相似性系數(shù)變化范圍為0.669 5～0.878 7。采用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)品種被分成了2組，其中香菇LB-21與香菇B15-1為一組，說(shuō)明這2個(gè)品種親緣關(guān)系相對(duì)較近，遺傳相似性系數(shù)為0.874 5;香菇L808與香菇215為一組，兩者親緣關(guān)系較近，遺傳相似性系數(shù)為0.878 7。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目? ?陜西省科技廳農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017NY-010）。

作者簡(jiǎn)介? ?雷萍（1966-），女，陜西西安人，副研究員，從事食藥用真菌的研究與開(kāi)發(fā)工作。

通信作者

收稿日期? ?2019-01-22