張海艷，路青青，楊偉平

(洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471934)

纖維素資源是地球上最豐富和廉價的可再生資源，包括農(nóng)作物秸稈、園林廢棄物、甘蔗渣及工業(yè)纖維廢渣等[1]。全世界通過光合作用產(chǎn)生的纖維素估計為1.55×109t/a，其中約89%尚未被利用[2]。我國的纖維素資源豐富，數(shù)量巨大，但由于纖維素難以降解，所以目前對其開發(fā)和利用非常有限，主要用于燃料、畜牧飼料與積肥，導(dǎo)致纖維素資源利用率很低，且造成環(huán)境污染[1-4]。產(chǎn)纖維素酶的微生物可將天然纖維素分解為葡萄糖等可利用的物質(zhì)，對解決污染、能源危機等問題，保障人類社會可持續(xù)發(fā)展具有重大意義[5-6]。因此，篩選產(chǎn)高活性纖維素酶的菌株，是開發(fā)利用纖維素資源的前提和關(guān)鍵。產(chǎn)纖維素酶微生物廣泛存在于土壤、極地海洋、溫泉、植物組織、動物體內(nèi)及真菌等生物樣品和環(huán)境中，其中，土壤中纖維素分解菌最多[7-8]。何楠等[9-16]對不同土壤中纖維素降解菌進(jìn)行分離、鑒定，并對其產(chǎn)酶活性進(jìn)行研究；周晨妍等[17-18]對產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

為了提高纖維資源的有效利用，開發(fā)纖維素降解菌劑，采用剛果紅染色法從河南省欒川縣龍峪灣森林公園腐殖質(zhì)土樣中分離篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，經(jīng)16S rRNA分子鑒定后，對其糖化水平和產(chǎn)酶活力進(jìn)行研究，旨在為豐富降解纖維素微生物資源，更好地利用纖維素資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集 從龍峪灣國家森林公園采集腐殖土樣，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 3，5-二硝基水楊酸、重蒸酚、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸及檸檬酸鈉等。

1.1.3 培養(yǎng)基 羧甲基纖維素(CMC)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基、濾紙條培養(yǎng)基，均參照文獻(xiàn)[10，19]配制。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將土壤樣品按10-6～10-2梯度用無菌蒸餾水稀釋備用。

1.2.2 纖維素降解菌的分離篩選

1)初篩。取100 μL稀釋液涂布于CMC平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑選繁殖狀況好的菌落，加入1 mg/mL剛果紅染液，覆蓋菌落12 min后吸去剛果紅染液，再加入NaCl溶液漂洗，觀察透明圈大小，保留圈大的菌落，即完成初步篩選。

2)純化培養(yǎng)。在超凈工作臺用滅過菌的接種環(huán)挑取初步篩選得到的少許菌落，接種至LB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)12 h，用三線法在CMC培養(yǎng)基上純化，37℃培養(yǎng)24 h，完成第1次純化培養(yǎng)，重復(fù)上述步驟培養(yǎng)4～5次。

3)復(fù)篩。在CMC培養(yǎng)基上點種，向培養(yǎng)基中倒入剛果紅染液，靜置12 min左右，NaCl溶液漂洗，并根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑大小選擇優(yōu)質(zhì)菌株。

1.2.3 濾紙降解測定 向濾紙條培養(yǎng)基中加1 mL菌液，濾紙大小為5 cm×1 cm，搖床培養(yǎng)1～12 d，每天定時觀察濾紙的崩解情況[16]。

1.2.4 糖化水平測定 葡萄糖(還原糖)測定采用DNS顯色法[20]。調(diào)整菌株濃度的OD540為0.5，然后以1∶100的比例接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基上制備粗酶液。粗酶液和緩沖液中的碳源充分反應(yīng)后，煮沸滅活，在室溫下測OD540值，計算菌株的產(chǎn)糖量。

1.2.5 酶活力測定 將pH 4.8，50℃條件下1 min內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U/mL)[21]。酶活力的計算公式：

X=[(A1-A2)×K+c]/(M×t)×1000

式中，X為CMCase活力，A1為OD540值，A2為對照OD540值，K為斜率，c為截距，M為葡萄糖的分子量，t為時間。

1.2.6 分離菌株鑒定

1)形態(tài)學(xué)鑒定。觀察細(xì)菌在CMC培養(yǎng)基上的生長狀況，包括形狀、形態(tài)、透明度、顏色及菌落質(zhì)地等。

2)革蘭氏染色。參照寧俊平[22]的方法，通過革蘭氏染色對菌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

3)分子鑒定。通過CTAB法[23]和溶菌酶[21]相結(jié)合提取細(xì)菌基因組DNA。將提取的基因組DNA作為模板，PCR擴增菌株的16S rRNA基因[24]。所得擴增后產(chǎn)物由北京中科希林生物科技公司測序。將測序結(jié)果在NCBI瀏覽器上用BLAST 程序進(jìn)行同源性分析，用Mega 7.0.26中的neighbor-joining法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 菌種的生長特性 調(diào)整菌液OD600=0.5作為種子液。以1∶100的比例接種至LB培養(yǎng)基中，每隔4 h測其OD600，并用PBS緩沖溶液做對照，記錄菌比體的生長情況并繪制菌絲體的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

從表1和圖1看出，反復(fù)劃線培養(yǎng)4～5次，經(jīng)剛果紅染色，篩選出7株透明圈較明顯的菌株，將其分別編號為LY-1、LY-2、LY-3、LY-4、LY-5、LY-6和LY-7。點種復(fù)篩后，各菌株在CMC培養(yǎng)基上的菌落直徑(d)與降解圈直徑(D)比的大小依次為LY-5>LY-6>LY-3>LY-1>LY-7>LY-4>LY-2。其中，菌株LY-1、LY-3、LY-5和LY-6的透明圈直徑比較大，可用于后續(xù)試驗。

表1 纖維素降解菌株的菌落與降解圈直徑Table 1 Colony and degradation circle diameter of cellulose-degrading strain

圖1纖維素降解菌株 LY-1、LY-3、LY-5和 LY-6剛果紅染色
Fig.1 Congo red staining of cellulose-degrading strains LY-1,LY-3,LY-5 and LY-6

2.2 分離菌株對濾紙條的降解

將菌株LY-1、LY-3、LY-5和LY-6進(jìn)行濾紙條降解試驗，結(jié)果表明，菌株LY-1和LY-5處理的溶液變渾濁，濾紙條接近糊狀，菌株LY-6處理的濾紙條成糊狀，菌株LY-3處理的濾紙條幾乎不降解。

2.3 分離菌株的糖化水平與酶活力

由圖2可見分離菌株的糖化水平與酶活力。1)糖化水平。4株菌株的糖化水平依次為LY-6>LY-1>LY-5>LY-3，其中，菌株LY-6產(chǎn)糖量最高，為0.045 mg/mL；其次是菌株LY-1，產(chǎn)糖量為0.035 mg/mL；菌株LY-3產(chǎn)糖量最低，為0.021 mg/mL。2)酶活力。4株菌株產(chǎn)纖維素酶的活力存在差異，其酶活力依次為LY-6>LY-1>LY-5>LY-3，其中，菌株LY-6的酶活力最高，為0.004 8 U/mL；菌株LY-3的酶活力最低，僅為0.001 3 U/mL。選擇菌株LY-6進(jìn)行鑒定。

圖2 纖維素降解菌 4個菌株的糖化水平與酶活力Fig.2 Saccharification level and enzyme activity of the four cellulose-degrading strains

2.4 菌株 LY-6的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從圖3可見，菌株LY-6的菌落呈近圓形，較小，不透明，表面光滑，呈乳白色，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]初步鑒定LY-6為芽孢桿菌屬的細(xì)菌。

圖3 纖維素降解菌株 LY-6的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of cellulose-degrading strain LY-6

2.4.2 菌株LY-6的16S rRNA基因序列分析 對提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)目的條帶大小為1 500 bp左右(圖4)。將基因序列在NCBI分析結(jié)果顯示，菌株LY-6的16S rRNA基因序列長度為1 183 bp，其與多株芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列的相似性高達(dá)97%。從Mega 7.0.26構(gòu)建的菌株LY-6系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)看，該菌株與BacillussafensisstrainNBRC 100820的親緣關(guān)系最近，相似性為99%，由此可確定菌株LY-6為沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)，命名為BacillussafensisLY-6。

圖4 纖維素降解菌株 LY-6的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Polymerase chain reaction product electrophoresis of cellulose-degrading strain LY-6

2.5 菌株 LY-6的生長曲線

由圖6可知，BacillussafensisLY-6在培養(yǎng)4～16 h內(nèi)，菌株的生長速率快，呈指數(shù)增長。在培養(yǎng)16～20 h內(nèi)，B.safensisLY-6處于穩(wěn)定期，OD600值最高可達(dá)0.804。24 h后菌株數(shù)量開始下降。

圖5 纖維素降解菌株LY-6 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of LY-6 16S rRNA gene sequence of cellulose-degrading strain

圖6 纖維素降解菌株 LY-6的生長曲線Fig.6 Growth curve of cellulose-degrading strain LY-6

3 結(jié)論與討論

從落葉腐殖質(zhì)土樣中分離篩選出的7株產(chǎn)纖維素酶菌株中，菌株LY-6的產(chǎn)酶特性最強，經(jīng)鑒定，該菌株為沙福芽孢桿菌(BacillussafensisLY-6)。該菌株在培養(yǎng)16～20 h內(nèi)生長比較穩(wěn)定，OD600值最高可達(dá)0.804。剛果紅染色LY-6菌株在CMC培養(yǎng)基上的透明圈直徑為1.40 cm，較明顯，該菌株的產(chǎn)糖量和產(chǎn)纖維素酶的活力分別為0.045 mg/mL和0.004 8 U/mL。

目前，真菌和細(xì)菌是分解纖維素的主要微生物。真菌通過胞外游離纖維素酶起作用，而細(xì)菌通過形成多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)起作用[26-28]。與真菌相比，細(xì)菌有生長速度較快、發(fā)酵時間短及產(chǎn)纖維素酶更容易獲得的優(yōu)點。顧挺等[29]從種稻紅壤篩選出枯草芽孢桿菌和綠色木霉菌；李潔等[15]從種竹林地紅壤篩選出1株芽孢桿菌；不同菌株適宜不同類型的土壤[9-16]，該研究篩選出的沙福芽孢桿菌來自落葉豐富的腐殖質(zhì)土壤。

當(dāng)代社會生態(tài)問題極其重要，纖維素是巨大的可再生資源，利用微生物分解纖維素資源，實現(xiàn)生物量的轉(zhuǎn)化和利用，有利于社會的可持續(xù)發(fā)展。纖維素酶在工業(yè)、食品、醫(yī)藥方面均有很大的應(yīng)用潛力[30-31]。該研究篩選的BacillussafensisLY-6屬沙福芽孢桿菌，其可以直接降解纖維蛋白，并且對血栓中的纖維蛋白有一定的降解特異性，對于口服溶栓藥的開發(fā)具有重要意義[30]。沙福芽孢桿菌纖溶酶活性較好，具有潛在開發(fā)價值。