董世武，王天嬌，張然然，唐麗昕，邢秀梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物重點實驗室，長春 130112）

鹿全身均可入藥，鹿產(chǎn)品更是多種多樣，且價格昂貴。我國歷代本草著作及現(xiàn)代藥典都將梅花鹿（Cervus nippon）和馬鹿（C.elaphus）的產(chǎn)品視為正品，其他鹿種的產(chǎn)品則多作為代用品、習(xí)用品或偽品[1]。由于產(chǎn)品在加工過程中其形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等均有不同程度的改變，傳統(tǒng)方法難以對產(chǎn)品的成分進行準確定性。分子檢測方法反應(yīng)靈敏，準確度高，給鹿源性產(chǎn)品成分的定性分析提供了技術(shù)支持。關(guān)于鹿科動物線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）的研究報道較多[2]，因而分子檢測方法大多利用種屬間mtDNA的差異進行檢測，主要有細胞色素 b（Bytochrome b，Cytb）基因、細胞色素C氧化酶I（COⅠ）基因以及12S rRNA，還有少數(shù)方法是基于Y染色體SRY基因的差異進行檢測。微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）作為分子標記，是分子檢測的有力工具。本文將近年來有關(guān)鹿源性產(chǎn)品成分分子檢測的研究進行綜述。

1 基于mtDNA的檢測研究

mtDNA為母系遺傳，突變率高，自發(fā)突變率超過nDNA（Nuclear DNA）約 20 倍[3]。

1.1 Cytb基因

Cytb基因在線粒體基因組中有著適中的進化速度，其一個小片段就能包含大量的系統(tǒng)發(fā)育信息，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定[4-5]、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及遺傳多樣性研究[6-7]等。在鹿源性產(chǎn)品成分的檢測應(yīng)用中，根據(jù)梅花鹿和馬鹿與其他物種之間Cytb基因序列的差異設(shè)計特異性引物，進行PCR擴增和電泳檢測，從目的片段大小、數(shù)目等的差異對樣品進行區(qū)分鑒定，不僅簡單快速，而且反應(yīng)靈敏、準確性高。結(jié)合隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）[8]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single strand conformation polymorphism，SSCP）[9]、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）[10-11]等技術(shù)，在鑒別鹿產(chǎn)品真?zhèn)蔚耐瑫r，還能夠?qū)⒚坊乖闯煞旨榜R鹿源成分準確區(qū)分，為鹿產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了有效的技術(shù)手段。

在常見肉制品的鑒定中，用Cytb基因通用引物對肉制品中提取的DNA進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序，并將序列與GenBank的已知序列進行對比分析，即可達到鑒定肉制品真?zhèn)蔚哪康腫12]。根據(jù)不同種動物Cytb基因的差異建立PCR種屬鑒別體系，結(jié)合常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，即可快速、準確區(qū)分體系中的物種，其中，對牛、牦牛、山羊DNA檢測的靈敏度在2.5 ng左右[13]。

1.2 COⅠ基因

COⅠ基因為線粒體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因，負責編碼細胞色素C氧化酶的一個強疏水性核心亞基--細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ[14]。作為DNA條形碼基因，COⅠ是目前物種鑒定常用的基因之一，而DNA條形碼技術(shù)則是對傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的有力補充[15]。在鹿產(chǎn)品成分的鑒定中，張蓉等[16]和崔麗娜等[17]均利用COⅠ序列的通用引物對鹿科不同種屬動物的鹿茸DNA進行擴增和測序，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以明顯區(qū)分正品鹿茸與其混偽品，證實該方法可用于鹿茸的真?zhèn)舞b定。劉冬等[18]基于COⅠ序列建立了鹿類藥材的分子鑒定方法，結(jié)果，所有鹿類藥材均可用COⅠ通用引物PCR擴增并測序，且數(shù)據(jù)庫中8種101份樣品物種間區(qū)分明顯，為市售鹿類藥材的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。高曉晨等[19]基于該方法對40份市售鹿茸飲片進行鑒定分析，正品僅占35%，其余65%均來源于馴鹿。賈靜等[20]對市售鹿茸藥材粉末樣品中獲得的COⅠ序列進行分析，65份樣品中38%為正品，62%為馴鹿為主的其他基原樣品，另外35份樣品中主要基原為梅花鹿或馬鹿，且存在以馬鹿茸粉冒充梅花鹿茸粉的現(xiàn)象。

在常見動物（牛、羊、豬、雞等）肉產(chǎn)品的分子鑒別中，COⅠ同樣能有效發(fā)揮其條形碼基因的作用，且鑒別成本低、速度快[21-22]，為動物源性食品的檢測提供了參考。

1.3 12SrRNA

12SrRNA位于mtDNA上的非編碼區(qū)，在動物源性成分的檢測鑒定、產(chǎn)品真?zhèn)舞b別上均有應(yīng)用。Wang等[23]利用12S rRNA加熒光標記，結(jié)合T-RFLP技術(shù)對12種動物肉（包括鹿肉）進行鑒定研究，結(jié)果該方法具有潛在的快速、準確鑒別動物種類的可行性和適應(yīng)性。Mohan等[24]對鼷鹿的12SrRNA進行了分析，并用通用引物進行了PCR擴增，經(jīng)限制性酶切后進行克隆和測序，可將鼷鹿與其他鹿種明確區(qū)分。白根本等[25]用通用引物對國內(nèi)梅花鹿、馬鹿等11種鹿的12SrRNA基因片段進行分析，設(shè)計了1對高特異性引物鑒別梅花鹿和馬鹿，結(jié)果12S rRNA片段可在種的水平上將不同的種區(qū)分，設(shè)計的特異性引物可準確區(qū)分梅花鹿和馬鹿。由此可見，12SrRNA在物種鑒定方面同樣有著重要的應(yīng)用價值。

2 基于SRY基因的檢測方法

SRY基因也稱為Y染色體性別決定區(qū)，已被應(yīng)用于馬鹿的遺傳多樣性研究[26]。魏藝聰?shù)萚27]用SRY基因作為父本標記，同時以COⅠ基因作為母本標記，對已知樣本的SRY基因和COⅠ基因進行測序分析，建立了雙位點特異PCR體系，用于梅花鹿、馬鹿及其雜交鹿茸的鑒別，其判定標準見表1。用該方法對已知樣品進行檢測，8個梅花鹿樣品、7個馬鹿樣品和5個馬 花雜交鹿樣品均呈陽性反應(yīng)，而馴鹿、水鹿等樣品則呈陰性反應(yīng)。

表1 樣品判定標準Table 1 The judgement standards of samples

3 microsatellite DNA的應(yīng)用

microsatellite DNA又稱為STR（Short tandem repeat，STR），即短串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)單元為1～6個核苷酸，組成的重復(fù)序列可達幾十個核苷酸，具有種屬和堿基組成的特異性[28]，在揭示物種遺傳多樣性[29-31]、遺傳特征和群體結(jié)構(gòu)分析[32]、基因分型[33]、物種鑒別[34]以及動物親緣關(guān)系鑒定[35]中均有應(yīng)用。Zachos等[36]首次利用核標記從13個微衛(wèi)星位點對歐洲分布范圍內(nèi)大部分地區(qū)的600多頭馬鹿進行了分析，計算其遺傳多樣性和有效種群大小時產(chǎn)生了最小的結(jié)果，與這些群體已知的瓶頸一致。在梅花鹿、馬鹿產(chǎn)品源性成分的鑒定上，尚未見到有關(guān)STR應(yīng)用的報道。

4 SNP的應(yīng)用

SNP作為分子標記，在許多物種應(yīng)用中表現(xiàn)出可靠性、敏感性和高度的信息含量[37-39]。Ba等[40]使用雙消化限制性酶切位點相關(guān)DNA測序技術(shù)（ddRAD-seq），從30個圈養(yǎng)個體（7個梅花鹿、6個馬鹿和17個F1雜交種）中檢測到約32萬個全基因組SNPs，通過篩選4個分類群體中每個SNP的雜合度，首次報道了2 015個假定的診斷性SNP標記（用于梅花鹿和馬鹿的物種特異性SNP）的資源，可用于梅花鹿與馬鹿之間雜交程度的評估或監(jiān)測，為全基因組的研究提供了寶貴資源；在42個不相關(guān)的個體（來自8個鹿場）[41]中產(chǎn)生了超過14.5億的高質(zhì)量配對讀數(shù)（288 Gbp），開發(fā)的一系列高質(zhì)量的SNP探針可能在將來用于鹿科物種基因分型。

5 小結(jié)

分子檢測方法大部分都是建立在PCR基礎(chǔ)上的，包括 PCR-RAPD[8]、PCR-SSCP[9]、PCR-RFLP[10-11]、RT-PCR（Real Time-PCR）[42-43]、Nano-PCR[44]以及LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[45]等，其原理是根據(jù)不同物種之間DNA序列的差異，設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，然后直接對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，根據(jù)電泳條帶的差異對樣品進行區(qū)分，或者結(jié)合酶切等技術(shù)，使難以區(qū)分的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生不同大小及數(shù)目的片段，從而對樣品進行區(qū)分；直接對PCR產(chǎn)物進行測序，然后與已有物種的相同區(qū)域的DNA序列進行比對與聚類分析，以達到鑒別目的。mtDNA在種內(nèi)相對保守，而種間差異較為明顯，因而被作為分子檢測的目的基因廣泛應(yīng)用。微衛(wèi)星和SNP分子標記雖然也是分子檢測方法的有力工具，但在鹿產(chǎn)品鑒別的應(yīng)用中還有待開發(fā)。

朱云飛等[46]對梅花鹿、馬鹿、馴鹿和新西蘭赤鹿的鹿茸蛋白進行分析，結(jié)果鹿茸蛋白條帶有15條，在7.5%分離膠系統(tǒng)中分別在34、35 ku處梅花鹿排血紗片有明顯條帶，147、142、138 ku處僅新西蘭赤鹿有蛋白條帶，這為不同品種鹿茸的定性研究提供了依據(jù)和基礎(chǔ)，但在產(chǎn)品加工過程中蛋白質(zhì)容易遭到破壞，導(dǎo)致該方法的適用性較差。分子檢測方法反應(yīng)靈敏、準確度高，能夠彌補利用蛋白差異進行檢測的不足，但在效率、成本等方面還有相當大的改善空間。隨著測序技術(shù)的發(fā)展及測序成本的降低，未來分子檢測方法的應(yīng)用將更加廣泛，這對于維護市場秩序和保證消費者權(quán)益具有重要意義。