付要，趙凌，赫一鳴，蔡廣知，李劍男，貢濟(jì)宇

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

兩頭尖為毛茛科植物多被銀蓮花（Anemone raddeana RegeL）的干燥根莖，性味辛、熱，有毒，歸脾經(jīng)，有祛風(fēng)濕、消癰腫的功效，用于治療風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、骨節(jié)疼痛、癰腫潰爛等，為治療風(fēng)濕病的要藥。兩頭尖醋制品出自古方《再造丸》，為其主要原料，在北京市2008版[1]中藥飲片炮制規(guī)范中收載有醋兩頭尖飲片。目前，關(guān)于醋兩頭尖炮制工藝及炮制作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，對(duì)醋兩頭尖的炮制工藝條件進(jìn)行了研究，以便規(guī)范醋兩頭尖飲片的炮制工藝，研究醋制前、后兩頭尖毒性及抗炎作用的變化，探究醋制對(duì)兩頭尖的作用[2]。

1 材料

1.1 儀器

1260 HPLC儀（美國(guó)Agi1ent公司）；AB135-S型電子分析天平〔梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司〕；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S24電熱恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

1.2 試劑與試藥

兩頭尖購(gòu)于吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室蔡廣知副教授鑒定；竹節(jié)香附素A（RDA）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111712-201702，純度≥98%）；米醋（市售，總酸≥90.0 g/L，以乙酸計(jì)）；乙腈、甲醇〔色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司〕；其余試劑均為分析純；水為超純水；弗氏完全佐劑（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：AC-0051）；IL-1、IL-6和TNF-E1ISA試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠80只，SPF級(jí)，雌、雄各半，體重18～22g；SD雄性大鼠60只，220～240 g，均由吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 醋制工藝優(yōu)選

2.1.1 考察指標(biāo)的確定 因中藥炮制機(jī)制的復(fù)雜性，單一化學(xué)成分的變化很難詮釋炮制效果的好壞，故采用外觀性狀與化學(xué)活性成分變化雙重指標(biāo)綜合加權(quán)優(yōu)選炮制工藝。

外觀性狀：參考北京市中藥飲片炮制規(guī)范2008年版“醋兩頭尖”規(guī)定[1]，選用斷面色澤及氣味2個(gè)外觀性狀指標(biāo)進(jìn)行工藝評(píng)價(jià)。外觀性狀評(píng)分見(jiàn)表1。

表1 外觀性狀評(píng)分Tab1e 1 Appearance traits score

化學(xué)活性指標(biāo)成分：兩頭尖藥材有效成分主要為總皂苷及單體皂苷竹節(jié)香附素A[3]。前期研究表明，不同炮制工藝條件下，其總皂苷含量無(wú)明顯變化，而單體皂苷竹節(jié)香附素A含量有明顯變化，故選取單體皂苷竹節(jié)香附素A作為化學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

對(duì)照品溶液的制備 參照《中國(guó)藥典》2015版兩頭尖“含量測(cè)定”項(xiàng)下對(duì)照品及供試品的制備工藝[4]。精密稱(chēng)取竹節(jié)香附素A對(duì)照品適量，分別制成1mg/mL的對(duì)照品溶液及 0.42、0.84、1.05、1.47、1.89、2.10mg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備 參照《中國(guó)藥典》2015版兩頭尖“含量測(cè)定”項(xiàng)下對(duì)照品及供試品的制備工藝[4]。取供試品粉末（過(guò)3號(hào)篩）5 g，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取3h，提取液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用乙醚振搖提取2次（20、10 mL），棄去乙醚液。水液用水飽和正丁醇振搖提取5次（20、20、15、15、15mL），合并正丁醇液，減壓回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS-C18（4.6 mm 250mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈A-0.1%磷酸溶液B進(jìn)行梯度洗脫（表2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm；進(jìn)樣量：10L；理論板數(shù)：按竹節(jié)香附素A峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 梯度洗脫Tab1e 2 Gradient e1ution

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）、樣品（B）色譜圖Fig.1 Standard（A）、sample（B）chromatogram

綜合評(píng)分：以外觀性狀及RDA含量為考察指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)。藥材炮制的效果一般均以炮制后飲片外觀性狀來(lái)判斷，故設(shè)定外觀性狀占60%，RDA含量占40%。

綜合評(píng)分=（斷面色澤評(píng)分+氣味評(píng)分）60%+RDA含量/同組最大RDA含量 100%40%

2.1.2 單因素試驗(yàn) 參照北京市中藥飲片炮制規(guī)范2008年版“醋兩頭尖”炮制工藝[1]，針對(duì)加醋量、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度、炒制時(shí)間4個(gè)因素，進(jìn)行不同水平的單因素考察[5]。

2.1.3 正交試驗(yàn) 在最佳加醋量下，考察悶潤(rùn)時(shí)間（A）、炒制溫度（B）及炒制時(shí)間（C）3個(gè)因素對(duì)兩頭尖醋制工藝的影響，D為空白因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，采用L9（34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)A、B、C及D進(jìn)行優(yōu)選，每組試驗(yàn)平行3次。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)因素與水平Tab1e 3 Factors and 1eve1s of orthogonal test

2.2 藥理試驗(yàn)

2.2.1 樣品制備 試驗(yàn)分優(yōu)選醋兩頭尖飲片組和對(duì)照組（兩頭尖藥材）2組。2組各取200g，加水浸泡30min，加入6倍量水，煎煮3次，每次1h，過(guò)濾，合并濾液[6]，濃縮成浸膏，80℃烘干至恒重，冷卻研磨成粉末，備用。

2.2.2 小鼠急性毒性試驗(yàn) 取SPF小鼠80只，雌、雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組（兩頭尖藥材）、最佳工藝炮制的醋制品2大組；每組分為4小組，依次取適量粉末加入0.05%CMC-Na溶解最大劑量組（0.4246g/mL）、1/2劑量組（0.2131g/mL）、1/4劑量組（0.1062g/mL）、1/8劑量組（0.052 5 g/mL），每組10只。各組禁食不禁水12 h后，灌胃給藥1次，給藥后小鼠自由進(jìn)食飲水。灌胃后24h內(nèi)觀察受試動(dòng)物的情況，以后每天觀察3次，連續(xù)7d，記錄各組動(dòng)物的體重、進(jìn)食、進(jìn)水情況、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)及存活情況[7]。

2.2.3 弗氏完全佐劑致大鼠足腫脹試驗(yàn) 取雄性大鼠60只，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、兩頭尖組、醋兩頭尖組?？瞻捉M與模型組給予生理鹽水10mL/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給予甲氨蝶呤片5mg/kg，兩頭尖及醋兩頭尖均按0.3 g/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6 d。末次給藥1 h后，將大鼠右后足皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL，測(cè)定造模后 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 6.0h右后足容積，給藥后右后足容積與給藥前之差作為腫脹度。取各組大鼠血液，備用，將大鼠處死。

腫脹度抑制率=（模型組腫脹度-給藥組腫脹度）/模型組腫脹度 100%

2.2.4 炎性因子的測(cè)定 取足腫脹試驗(yàn)大鼠血液樣品，按照E1ISA法檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-炎癥因子，并在450 nm處測(cè)定OD值[8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 竹節(jié)香附素A含量測(cè)定方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系 吸取配制好的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣體積為10L，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=6.12E+0.6x+41 179.19（r=0.999 2），在 0.42～2.10 mg/mL時(shí)RDA與峰面積線性關(guān)系良好。

3.1.2 精密度 取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10L，按色譜條件測(cè)定，以RDA峰面積計(jì)算RSD值為0.79%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性 稱(chēng)取醋兩頭尖粗粉約5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液制備方法制備，分別放置0、4、8、12、24 h后進(jìn)樣，進(jìn)樣量10L，按色譜條件測(cè)定，以RDA峰面積計(jì)算RSD值為1.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4 重復(fù)性 平行稱(chēng)取同批醋兩頭尖粗粉6份，按供試品溶液制備方法制備，分別進(jìn)樣10L，按色譜條件測(cè)定，以RDA峰面積計(jì)算RSD值為1.13%，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收率 稱(chēng)取已知含量的供試品2.5g，精密稱(chēng)定，按1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5加入RDA對(duì)照品，各平行3次，按供試品溶液制備方法制備，計(jì)算平均回收率為98.44%，RSD值為1.81%，表明該方法加樣回收率良好。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 加醋量 取凈兩頭尖10份，各100g，每2份平行為1組，分別加入質(zhì)量為兩頭尖質(zhì)量的10%、15%、20%、25%和30%食用醋，拌勻、悶潤(rùn)，待醋被吸盡、潤(rùn)透后，文火炒干，取出，晾涼，進(jìn)行測(cè)評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。由表4和圖2可知，加醋20%的炮制效果最佳。因此醋兩頭尖炮制用醋量為20%。

表4 加醋量考察結(jié)果Tab1e 4 Resu1ts of different propotion of vinegar

圖2 加醋量考察結(jié)果Fig.2 Resu1ts of different propotionsof vinegar

3.2.2 悶潤(rùn)時(shí)間 取凈兩頭尖10份，各100g，每2份平行為1組，加入20%食用醋，拌勻，分別悶潤(rùn)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h，文火炒干，取出，晾涼，進(jìn)行測(cè)評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表5、圖3。由表5和圖3可知，悶潤(rùn)時(shí)間為2 h時(shí)炮制效果最佳。因此悶潤(rùn)時(shí)間定為2 h。

3.2.3 炒制溫度 取凈兩頭尖10份，各100g，每2份平行為1組，加入20%食用醋拌勻，悶潤(rùn)2 h，分別在80、100、120、140、160 ℃下炒制，炒干，取出，晾涼，進(jìn)行測(cè)評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表6、圖4。由表6和圖4可知，120℃下炒制的兩頭尖色澤較好，質(zhì)量佳，綜合評(píng)分高，故選用120℃作為炒制溫度。

表5 悶潤(rùn)時(shí)間考察結(jié)果Tab1e 5 Resu1ts of different stuffy times

表6 炒制溫度考察結(jié)果Tab1e 6 Resu1tsof different stir-fried temperatures

圖3 悶潤(rùn)時(shí)間考察結(jié)果Fig.3 Resu1ts of different stuffy time

3.2.4 炒制時(shí)間 取凈兩頭尖10份，各100g，每2份平行為1組。加入20%的食用醋拌勻，悶潤(rùn)2 h，120℃翻炒，分別炒制3、5、10、20、30、40min，炒制后取出，晾涼，進(jìn)行測(cè)評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表7、圖5。由表7、圖5可知，炒制10 min時(shí)效果最好，且節(jié)省能量，故確定炒制10 min。

圖4 炒制溫度考察結(jié)果Fig.4 Resu1ts of different stir-fried temperatures

表7 炒制時(shí)間的考察結(jié)果Tab1e 7 Resu1ts of different stir-fried times

圖5 炒制時(shí)間的考察結(jié)果Fig.5 Resu1ts of different stir-fried times

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響為A＞C＞B，A因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，B、C因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著；結(jié)合方差分析和直觀分析結(jié)果，確定最佳炮制工藝為A1B3C1。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，方差分析見(jiàn)表9。

為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，按正交試驗(yàn)得出的兩頭尖最佳醋制工藝方法進(jìn)行3批炮制試驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢查，以考察工藝的合理性。結(jié)果，最佳工藝所得飲片的外觀性狀、RDA含量及綜合評(píng)價(jià)RSD＜3%均較為穩(wěn)定，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定、可行。

3.4 藥理試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 兩頭尖及醋兩頭尖對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn) 給藥后2 h內(nèi)原藥材的最大劑量組與1/2劑量組出現(xiàn)死亡，其他劑量組小鼠狀態(tài)不佳，表現(xiàn)較為安靜，活動(dòng)減少，3～4d陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。醋制品組小鼠生理活性指標(biāo)正常，活動(dòng)減少，但無(wú)死亡現(xiàn)象。結(jié)果證明，兩頭尖具有急性毒性，其半數(shù)致死量LD50為52.56 g/kg，醋兩頭尖無(wú)急性毒性表現(xiàn)，說(shuō)明兩頭尖經(jīng)炮制后其毒性降低。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab1e 8 Resu1ts of orthogona1 test

表9 方差分析結(jié)果Tab1e 9 Result of variance ana1ysis

3.4.2 兩頭尖及醋兩頭尖對(duì)弗氏完全佐劑所致大鼠足腫脹的影響 由表10可知，0.5h后，模型組腫脹度明顯增加，說(shuō)明造模成功。4 h后各藥物組的足跖腫脹度均明顯降低，與模型組比較，醋兩頭尖組在給藥2h時(shí)腫脹度與模型組有顯著差異，且腫脹消除度遠(yuǎn)高于兩頭尖組，說(shuō)明經(jīng)炮制后的醋兩頭尖對(duì)足腫脹的治療更有效。

表10 各組大鼠足腫脹度及抑制率Tab1e 10 Rat foot swelling and inhibition rates （,n=10）

表10 各組大鼠足腫脹度及抑制率Tab1e 10 Rat foot swelling and inhibition rates （,n=10）

注：與模型對(duì)照組比較，*.P＜0.05；**.P＜0.01Note:Compared with themode1 group,*.P＜0.05；**.P＜0.01

組別Group劑量（mg/kg）Dose腫脹度（mm）Swelling degree抑制率（%）Inhibition rate 0.5 h 1.0 h 2.0 h 3.0 h 4.0 h 6.0 h 0.5 h 1.0 h 2.0 h 3.0 h 4.0 h 6.0 h模型組Model group 0 7.83±0.75 8.51±0.63 8.63±0.36 8.41±0.42 7.93±0.36 7.25±0.35 0 0 0 0 0 0陽(yáng)性藥組Positive medicine group 5 6.88±0.85 7.56±0.54 7.62±0.46 6.65±0.63* 6.29±0.37** 5.11±0.63**12.1311.1611.7020.9320.6829.52兩頭尖組A.raddeana rhizoma group 300 7.31±0.37 7.54±0.85 6.90±0.37*6.43±0.31**6.09±0.69** 5.27±0.44** 6.64 11.4020.0423.5423.2027.31醋兩頭尖組Vinegar-prepared A.raddeana rhizomagroup 300 7.12±0.65 6.99±0.31 6.46±0.45*6.18±0.67**6.01±0.35** 4.79±0.46** 9.07 17.8625.1426.5224.2133.93

表11 各組大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-含量Tab1e 11 Serum IL-1,IL-6 and TNF-content in rats （,n=10）

表11 各組大鼠血清IL-1、IL-6和TNF-含量Tab1e 11 Serum IL-1,IL-6 and TNF-content in rats （,n=10）

注：與模型組比較，*.P＜0.05；**.P＜0.01Note:Compared with themode1 group,*.P＜0.05；**.P＜0.01

組別 Group 劑量（mg/kg）Dose IL-1（pg/mL） IL-6（pg/mL） TNF-（pg/mL）模型組Model group - 150.59±9.85 143.87±11.66 145.61±5.12陽(yáng)性藥組Positive medicinegroup 5 55.31±6.33** 107.52±10.19** 93.02±6.17**兩頭尖組A.raddeanarhizoma group 300 97.94±12.32** 127.06±9.94* 108.14±5.49**醋兩頭尖組Vinegar-prepared A.raddeanar hizoma group 300 68.37±10.71** 117.98±10.53** 102.59±7.13**

4 結(jié)論與討論

該研究以炮制后飲片外觀性狀及化學(xué)活性成分竹節(jié)香附素A的含量為指標(biāo)加權(quán)綜合評(píng)價(jià)，通過(guò)單因素考察和正交試驗(yàn)進(jìn)行炮制工藝篩選，確定最佳醋制工藝為加醋量為原藥材質(zhì)量的20%、悶潤(rùn)時(shí)間2 h、炒制溫度120℃、翻炒時(shí)間10min，對(duì)兩頭尖醋制工藝進(jìn)行了規(guī)范化，更加客觀地控制飲片質(zhì)量。

中藥醋制能夠起到緩和藥性、降低毒副作用、增強(qiáng)療效、引藥入肝的作用，本研究通過(guò)急性毒性試驗(yàn)、弗氏完全佐劑致大鼠足腫脹試驗(yàn)及IL-1、IL-6和TNF-炎性因子含量的測(cè)定，說(shuō)明兩頭尖醋制作用為“增效減毒”，即醋制后兩頭尖毒性降低，抗炎活性增強(qiáng)。