馮耀培，曲正義，金銀萍，李紅鈺，李淵，鄭斯文，王英平

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是通過飲用酒精類飲料所導(dǎo)致的肝損傷的一種疾病，其損傷程度與酒精攝入量和飲用時間呈正相關(guān)。酒精性肝損傷分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化，嚴重者可演化為肝癌[1]。近年來，我國酒精性所導(dǎo)致的肝損傷現(xiàn)象逐年上升，ALD已成為僅次于病毒性肝炎的第二大元兇[2]。酒精性肝損傷會導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭等多種肝病的發(fā)生[3]，因此，建立酒精性肝損傷模型，開展中藥對肝損傷的保護性以及緩解或治療急慢性肝病的研究意義深遠。

云芝是多孔菌科真菌彩絨革蓋菌〔Coriolusversicolor（L.ex Fr.）Quel〕的干燥子實體，全國各地均有分布，東北地區(qū)為主產(chǎn)區(qū)，是一種常用中藥，收載于《中國藥典》2015年版一部[4]。云芝的主要活性成分為云芝多糖，具有多種生物活性。已有研究表明，云芝多糖具有治療實驗性肝病的作用[5-6]，但對于酒精性肝損傷的研究較少，王康樂等[7]初步探討了云芝組分對酒精肝損傷小鼠的保肝活性。本試驗通過給藥云芝提取物（Coriolusversicolor extracts，CVE）對小鼠進行肝臟預(yù)防性保護，然后建立急性酒精肝損傷模型，評價肝臟損傷程度、肝臟功能、脂肪含量及抗氧化酶活性，并探討CVE對酒精性肝損傷的預(yù)防作用。

1 材料與試劑

1.1 材料

SPF級雄性ICR小鼠，60只，6～8周，體重18～22g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（吉）-2015-0001；水飛薊素（純度≥98%，陜西森弗天然制品有限公司）；云芝提取物由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所新藥創(chuàng)制實驗室提?。兌取?5%）。

1.2 試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（T-CHO）試劑盒、低密度蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒、高密度蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其他試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 儀器

離心機（TGL-16K，湖南湘儀離心機廠）；酶標儀（BioTek-Epoch，美國 BioTek公司）；超聲波清洗器（SK5200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-4，常州澳華儀器公司）；電子天平（FA1004B、YP5002，上海越平科學儀器有限公司）；包埋機（LEICA EG 1150H）、切片機（LEICA RM2255）（德國徠卡公司）；攤片機（KD-T，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；組織勻漿破碎儀（Coyote-Bio G200，卡尤迪生物科技有限公司）；光學顯微鏡〔BX53，奧林巴斯（中國）有限公司〕。

2 方法

將60只雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，充足飲食后隨機分為正常對照組、模型組、CVE低〔50mg/（kg·d）〕、中〔100 mg/（kg·d）〕、高〔300 mg/（kg·d）〕劑量組和陽性對照組（50mg/kg水飛薊素）。試驗期間，保持動物飼養(yǎng)溫度為（25±2）℃，自由飲食。給藥前將小鼠稱重，隔天稱重1次，灌胃周期為30 d，末次給藥后禁食、不禁水12h。除正常對照組外，其余各組均采用50%乙醇以14mL/kg的劑量，建立酒精性急性肝損傷模型[8]。24 h后解剖。摘眼球取血，測定血清相關(guān)生理生化指標。處死小鼠后進行解剖，取肝臟，用4℃生理鹽水洗凈，在濾紙上吸干水分，然后，將小鼠肝臟左葉剪下，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，以備病理學研究；將剩余肝組織置于液氮中，勻漿后檢測肝組織相關(guān)指標。

2.1 血清生理生化指標的檢測

血液樣品4℃冰箱內(nèi)靜置2h，冷凍離心機3500r/min離心10min，吸取上清，將血清按照各指標所需樣品量進行分裝并標記，置于 20℃冰箱內(nèi)，檢測血清ALT、AST、MDA、T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C 等生理生化指標，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.2 肝組織的病理變化

取固定的肝組織，切規(guī)則方形小塊（0.5 cm 1.0 cm 0.5cm），置于包埋盒內(nèi)，流水沖洗，脫水，透明，浸蠟，包埋。將切片蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織的病理變化。

2.3 肝組織相關(guān)指標的檢測

取置于液氮內(nèi)保存的肝組織樣本，制成10%濃度的組織勻漿，檢測蛋白質(zhì)含量、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性等指標，檢測方法嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，結(jié)果均以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用T-test檢驗分析，P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 CVE對酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠中央靜脈及其周圍肝細胞圓潤，細胞索清晰可見，細胞核呈現(xiàn)規(guī)則圓形，核質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)豐富，肝細胞胞漿未見脂肪變性及氣球樣變，肝細胞無壞死、無炎性浸潤等現(xiàn)象（圖1A）；模型組小鼠肝組織損傷嚴重，中央靜脈周圍可見細胞呈現(xiàn)碎片狀壞死，壞死的細胞出現(xiàn)核固縮、溶解、消失現(xiàn)象（圖1 B），表明急性酒精性肝損傷模型造模成功；CVE低、中劑量組出現(xiàn)輕微肝細胞脂變、炎性浸潤現(xiàn)象（圖1D、E）；陽性對照組及CVE高劑量組小鼠肝組織細胞核清晰完整，肝細胞無壞死及炎性浸潤現(xiàn)象，肝組織細胞損傷狀況得到明顯改善，且 CVE高劑量組小鼠部分肝細胞出現(xiàn)細胞再生現(xiàn)象（圖1 F）。

圖1 CVE對小鼠肝臟病理形態(tài)的影響（比例尺=40 m）Fig.1 Effects of CVEon the liver'spathological morphology in mice(scal bar=40 m)

3.2 CVE對酒精性肝損傷小鼠血清生理生化指標的影響

表1 CVE對小鼠血清AST、ALT活性的影響Table 1 Effects of CVEon AST and ALT activities in the serum of mice （,n=10）

表1 CVE對小鼠血清AST、ALT活性的影響Table 1 Effects of CVEon AST and ALT activities in the serum of mice （,n=10）

注：#.與正常對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；##.與正常對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）；*.與模型組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01）。Note:#.Significant differences with normal control group(P＜0.05);##.Extremely significant differences with normal control group(P＜0.01);*.Significant differences with model group(P＜0.05);**.Extremely significant differences with model group(P＜0.01).

組別Group劑量〔mg/（kg·d）〕Dose ALT活性（U/L）ALT activity AST活性（U/L）AST activity正常對照組 Normal control group 25.96±1.64 61.86±19.00模型組 Model group 45.25±21.25# 141.16±60.18##陽性對照組 Positivecontrol group 29.42±5.05* 88.80±26.24**CVE低劑量組 Low-dose of CVEgroup 50 24.95±5.94* 71.02±29.06**CVE 中劑量組 Medium-dose of CVEgroup 100 27.88±2.65* 66.22±17.77**CVE高劑量組 High-doseof CVEgroup 300 22.73±8.63* 61.77±17.55**

由表1可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST活性均顯著升高（P＜0.05），說明CVE給藥能顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST活性（P＜0.05），且對二者的降低作用均呈現(xiàn)劑量依賴性，同時CVE高劑量組的效果強于陽性對照組。

表2 CVE對小鼠血清MDA、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影響Table 2 Effects of CVEon the serum MDA and TGand TCand LDL-Cand HDL-Ccontents in mice （,n=10）

表2 CVE對小鼠血清MDA、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影響Table 2 Effects of CVEon the serum MDA and TGand TCand LDL-Cand HDL-Ccontents in mice （,n=10）

組別Group劑量〔mg/（kg·d）〕Dose MDA（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）正常對照組 Normal control group 11.22±1.66 1.02±0.34 4.57±1.22 0.20±0.07 2.64±0.40模型組 Model group 16.26±3.37## 2.48±1.20## 6.97±1.39## 0.46±0.26## 1.38±0.47##陽性對照組 Positivecontrol group 10.50±2.81** 1.05±0.42** 4.50±1.31** 0.17±0.12** 2.12±0.34**CVE 低劑量組 Low-doseof CVEgroup 50 19.92±9.14 2.21±1.17 6.08±1.68 0.29±0.09 1.63±0.38 CVE 中劑量組 Medium-doseof CVEgroup 100 13.74±1.40 1.62±0.96 4.29±1.10** 0.35±0.15 2.16±0.34**CVE 高劑量組 High-doseof CVEgroup 300 11.24±1.25* 1.10±0.56** 3.55±1.18** 0.29±0.10 3.18±0.65**

由表2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠血清中MDA、TG、TC、LDL-C含量極顯著升高（P＜0.01），HDL-C含量極顯著降低（P＜ 0.01）；陽性對照組MDA、TG、TC、LDL-C含量與模型組相比均顯著降低（P＜0.01），HDL-C含量明顯升高（P＜0.01）；CVE中、高劑量組MDA含量均低于模型組，CVE各劑量組TG含量低于模型組，且CVE高劑量組MDA和TG含量極顯著低于模型組（P＜0.01）；CVE各劑量組的TC含量均低于模型組，且中、高劑量組TC含量極顯著低于模型組（P＜0.01）；CVE各劑量組HDL-C含量均高于模型組，且中、高劑量組HDL-C含量極顯著高于模型組（P＜0.01）；CVE高劑量組小鼠血清各項指標均高于CVE中、低劑量組及陽性對照組。

3.3 CVE對小鼠酒精性肝損傷肝組織相關(guān)指標的影響

表3 CVE對小鼠肝組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影響Table 3 Effectsof CVEon SOD ，GSH-Px and CAT activities and MDA content in the liver tissues of mice （,n=10）

表3 CVE對小鼠肝組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影響Table 3 Effectsof CVEon SOD ，GSH-Px and CAT activities and MDA content in the liver tissues of mice （,n=10）

組別Group劑量 Dose〔mg/（kg·d）〕SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）CAT（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）正常對照組 Normal control group 40.40±10.25 3.70±1.04 142.15±23.03 12.53±8.65模型組 Model group 35.13±8.00 2.47±0.97# 111.55±29.80# 32.57±5.63##陽性對照組 Positivecontrol group 51.69±11.10** 2.99±0.72 174.17±40.40** 24.58±8.75*CVE 低劑量組 Low-doseof CVEgroup 50 43.74±22.13 2.76±0.72 205.59±43.60** 28.48±8.34 CVE 中劑量組 Medium-doseof CVEgroup 100 75.35±15.06** 2.43±0.45 210.54±20.94** 27.15±13.37 CVE 高劑量組 High-dose of CVEgroup 300 53.21±16.74** 3.31±0.84* 183.81±35.2** 21.14±7.36**

由表3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活性降低，其中CAT和GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05）；與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。陽性對照組SOD、GSH-Px、CAT活性均高于模型組，其中，SOD、CAT活性極顯著高于模型組（P＜0.01）；陽性對照組小鼠肝組織中MDA含量顯著低于模型組（P＜0.05）。CVE各劑量組SOD活性均高于模型組，中、高劑量組極顯著高于模型組（P＜0.01）；CVE各劑量組CAT活性均極顯著高于模型組（P＜0.01）；CVE高、低劑量組GSH-Px活性高于模型組，且CVE高劑量組GSH-Px活性顯著高于模型組（P＜0.05）；CVE各劑量組MDA含量均低于模型組，CVE高劑量組MDA含量極顯著低于模型組（P＜0.01）。CVE高劑量組小鼠肝組織勻漿各項指標均高于CVE中、低劑量組和陽性對照組。

4 討論

本研究通過酒精灌胃小鼠建立實驗動物模型，該方法周期性短、重復(fù)性好、死亡率低、穩(wěn)定性強、可行度高，建模方式與人類飲酒行為類似，對肝組織的損傷特點相似度高[9]。本試驗通過觀察肝臟病理組織切片發(fā)現(xiàn)，模型組肝臟組織細胞出現(xiàn)大量細胞溶解、脫落現(xiàn)象，表示酒精肝損傷模型造模成功。本研究發(fā)現(xiàn)，CVE能顯著改善酒精造成的肝細胞脫落、溶解以及脂肪變性等現(xiàn)象，且高劑量效果最優(yōu)。

肝臟損傷最敏感的檢測指標是血清ALT、AST活性。在機體中，ALT和AST主要存在于肝細胞內(nèi)。當肝細胞膜通透性增加時，即使沒有出現(xiàn)細胞受損以及壞死現(xiàn)象，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶仍然會明顯通過較高的濃度差而進入到血液中[10]。當肝細胞出現(xiàn)輕微壞死時，細胞內(nèi)ALT、AST等就會大量游離出來，致使血清中ALT、AST活性急劇升高，并最終導(dǎo)致肝細胞的壞死。轉(zhuǎn)氨酶活力的升高在一定程度上反映了肝細胞的損傷程度[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CVE可以顯著降低ALT、AST活性，效果優(yōu)于陽性對照組，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

肝細胞內(nèi)存在完善的抗氧化防御系統(tǒng)，主要由SOD、CAT、GSH-Px等組成的酶反應(yīng)體系，可以有效清除機體產(chǎn)生的自由基。當產(chǎn)生的自由基超過自身防御系統(tǒng)的清除能力時，就會發(fā)生氧化損傷，最為嚴重的部位為肝臟[15]。當脂質(zhì)過氧化發(fā)生時，會有MDA生成；當MDA含量增加時，會促進肝細胞膜的通透性，加大細胞中的可溶性酶進入血中，從而導(dǎo)致肝細胞膜功能發(fā)生改變，加重肝臟損傷，最終導(dǎo)致肝臟病變[16]。因此，SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量可以作為評價肝臟受到損傷程度的檢測指標。通過本試驗發(fā)現(xiàn)，CVE能夠顯著增加SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性，降低MDA含量，且整體來看，CVE高劑量組的效果優(yōu)于CVE中、低劑量組以及陽性對照組。

氧化產(chǎn)物的增加導(dǎo)致機體的氧化還原系統(tǒng)失衡時，會造成MDA、TG、TC、LDL-C等的積累，導(dǎo)致血脂代謝發(fā)生紊亂。血脂代謝的紊亂與HDL-C含量異常降低以及LDL-C的含量異常升高有密切關(guān)系。馬建林等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當機體內(nèi)TG含量升高時，常常伴隨著HDL-C含量的降低，從而減弱膽固醇從周圍組織轉(zhuǎn)運到肝臟中的能力，導(dǎo)致肝臟動脈粥樣硬化形成，這會導(dǎo)致TG在肝細胞內(nèi)大量積聚，進而造成脂肪病變，迫使脂肪轉(zhuǎn)變儲脂器官，最終會導(dǎo)致酒精性脂肪肝的形成[18-19]。曹丹等[20]在大紅袍水提物對小鼠酒精性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，灌胃大紅袍水提物組小鼠外周組織細胞中膽固醇含量降低，說明大紅袍水提物可以有效調(diào)節(jié)血脂代謝平衡。本試驗發(fā)現(xiàn)，CVE可使小鼠血清中MDA、TG、TC、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高，且CVE高劑量組的效果優(yōu)于陽性對照組。

綜上所述，云芝提取物可對酒精造成的急性肝損傷起到較好的保護作用，同時，能夠維持正常的肝功能與肝內(nèi)抗氧化酶活性。該研究為中藥云芝的藥理研究及其開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。