郝秀華，孫悅，王蕾，楊錦竹

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

野黃芩素也稱燈盞乙素苷元，為燈盞乙素脫去1個(gè)葡萄糖后的多羥基黃酮類化合物。近年來(lái)研究表明，其具有較燈盞乙素更為廣泛的藥理作用，如腦缺血保護(hù)作用[1]、抗炎抗癌作用[2-3]及抗帕金森癥[4-5]等具有良好的藥用潛質(zhì)。但由于化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定及體內(nèi)代謝復(fù)雜[6-7]，該藥物在制備方法及藥動(dòng)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域尚有較大研究空間。目前，關(guān)于野黃芩素制備主要有全合成法[8-9]、水解法[10]（也稱半合成法）及生物轉(zhuǎn)化法[11]等。水解法較其他方法具有反應(yīng)物易獲得、產(chǎn)物較為純凈和制備方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)在廖霞俐[12]及周榮光等[13]建立的水解法基礎(chǔ)上，利用CCD（Central composite design，CCD）優(yōu)化水解反應(yīng)條件，旨在得到更為高效的野黃芩素制備方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

野黃芩素對(duì)照品（≥98%，上海榮創(chuàng)生物技術(shù)有限公司）；燈盞乙素（95.5%，云南玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司）；磷酸二氫鉀（AR，20100906，北京化工廠）；冰醋酸（AR，20061019，北京化工廠）；甲醇（色譜純，20160805156，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司）；乙腈（色譜純，國(guó)營(yíng)浙江黃巖化學(xué)實(shí)驗(yàn)廠）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

玻璃點(diǎn)樣玻璃管（華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；硅膠G薄層板（20140806，青島海洋化工廠分廠）；SHIMADZU高效液相色譜系統(tǒng)（SPD-20A型紫外檢測(cè)器，LC-20AT泵，日本島津公司）；N2000色譜工作站（浙江大學(xué)）。

1.3 野黃芩素制備

稱取適量燈盞乙素于三頸燒瓶中，加入95%乙醇，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入濃硫酸，75℃水浴加熱至反應(yīng)結(jié)束，以薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程[14-15]。反應(yīng)結(jié)束后，立即向三頸瓶中傾入大量蒸餾水，體積為反應(yīng)介質(zhì)3～5倍量，使沉淀析出。將沉淀快速濾過(guò)并以蒸餾水洗滌至中性，真空烘干即得野黃芩素粗品，稱重，冷藏待用[12-13]。

1.4 單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)過(guò)程中影響產(chǎn)物純度、收率及反應(yīng)時(shí)間的因素主要為燈盞乙素與95%乙醇固液比、硫酸加入量、反應(yīng)溫度，故分設(shè)不同水平，以完全反應(yīng)所用時(shí)間及野黃芩素粗品收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素考察試驗(yàn)。

1.5 CCD制備工藝優(yōu)化

CCD是一種通過(guò)繪制試驗(yàn)結(jié)果的二維或三維效應(yīng)面圖以直接選取最優(yōu)工藝條件的高效直觀、多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，在藥物制劑處方優(yōu)選或化學(xué)合成工藝優(yōu)選方面得到了廣泛應(yīng)用[16-18]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合CCD進(jìn)行野黃芩素半合成工藝條件優(yōu)選。

由于選取的評(píng)價(jià)指標(biāo)反應(yīng)完全所需要的時(shí)間取值越小越好，而粗品收率取值越大越好，因此采用歸一化法來(lái)綜合2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)[19]，即對(duì)于取值越大越好的因素，即試驗(yàn)中粗品收率（Y1），歸一值d1=dmax=（yi-ymin）/（ymax-ymin）；對(duì)于取值越小越好的因素，即試驗(yàn)中完全反應(yīng)所需時(shí)間（Y2），歸一值 d2=dmin=（ymax-yi）/（ymax-ymin）；總評(píng)歸一值，OD（Overall desirability）=（d1d2）1/2，則OD值越大，表示反應(yīng)條件越有利于野黃芩素制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察

2.1.1 燈盞乙素與95%乙醇固液比 反應(yīng)溫度75℃，每0.15 g燈盞乙素加入硫酸量2.5 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)。分設(shè)固液比梯度，考察燈盞乙素與95%乙醇固液比對(duì)制備工藝的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，燈盞乙素與95%乙醇固液比對(duì)反應(yīng)影響加大，OD值有明顯波動(dòng)。故以燈盞乙素與95%乙醇固液比（X1）為主要考察因素，利用CCD法對(duì)合成工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[20]。

圖1 固液比對(duì)制備工藝的影響Fig.1 Effects of different solid-liquid ratios on preparation process

2.1.2 反應(yīng)溫度 燈盞乙素與95%乙醇固液比為15 g/L（0.15 g燈盞乙素加入10 mL 95%乙醇），且每0.15 g燈盞乙素加入硫酸量2.5mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)。分設(shè)溫度梯度，考察反應(yīng)溫度對(duì)制備工藝的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)影響加大，OD值有明顯波動(dòng)。故以反應(yīng)溫度（X2）為主要考察因素，利用CCD法對(duì)合成工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[20]。

圖2 溫度對(duì)制備工藝的影響Fig.2 Effects of different temperatures on preparation process

2.1.3 硫酸加入量 燈盞乙素與 95%乙醇固液比為15g/L，反應(yīng)溫度75℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)。燈盞乙素0.15g中分別加入不同量濃硫酸，考察硫酸加入量對(duì)制備工藝的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，反應(yīng)中加入硫酸的量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響相對(duì)較小，綜合考慮制備成本，選擇硫酸加入量為3 mL。

圖3 硫酸加入量對(duì)制備工藝的影響Fig.3 Effectsof different amounts of sulfuric acid on preparation process

2.2 CCD制備工藝

因素水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、2。以SAS軟件處理表2，以O(shè)D值為指標(biāo)，對(duì)X1、X2進(jìn)行多元線性回歸，多元線性回歸方程：Y=1.647 6+0.005 6 X1+0.027 7 X2，R=0.576 4，P=0.132 8，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此多元線性回歸方程未通過(guò)檢測(cè)，不能真實(shí)地反映各因素對(duì)指標(biāo)的影響。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二項(xiàng)式分布擬合得Y=5.9390+0.1259X1+0.1226X20.0049X120.0007 X22+0.0004X1X2。R=0.8763，P=0.0347。相較于多元線性回歸方程，選用二項(xiàng)式擬合模型作為該試驗(yàn)的擬合模型。經(jīng) Statistica6.0繪制等高線及效應(yīng)面圖見(jiàn)圖4、5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 CCD因素與水平Table 1 Levels and factorsof CCD

表2 CCD試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of CCD

圖4 等高線圖Fig.4 The contour plot

圖5 效應(yīng)面圖Fig.5 The 3D surface plot

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由圖4、5可知，效應(yīng)面為不規(guī)則曲面，故各因素與總歸一值間存在非線性關(guān)系。OD值越大試驗(yàn)結(jié)果效果越好即曲面頂端為最優(yōu)值[21]，最佳工藝條件為固液比15～17g/L、反應(yīng)溫度80～85℃。在較佳范圍內(nèi)任取3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification experiment

由表4可知，二項(xiàng)式模型的R為0.8763，Prob＞F值0.03，回歸方程擬合良好，模型建立較顯著（P＜0.05），此模型可以很好地對(duì)燈盞乙素水解制備野黃芩素的工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖4、5可以觀察到該試驗(yàn)結(jié)果的最佳區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)選取對(duì)應(yīng)的工藝條件即可獲得較理想的試驗(yàn)結(jié)果，即當(dāng)固液比15～17g/L、反應(yīng)溫度80～85℃時(shí)，可通過(guò)較短時(shí)間得到較理想的產(chǎn)物收率。驗(yàn)證試驗(yàn)的OD值偏差均較小，表明擬合方程的預(yù)測(cè)性良好，可用于燈盞乙素水解制備野黃芩素的工藝優(yōu)化。

2.3 產(chǎn)物純化

將所得干燥野黃芩素粗品以甲醇溶解后，加入少量冰醋酸，通入氮?dú)?，排出容器中空氣，并定時(shí)進(jìn)行氮?dú)馀艢獗Ｗo(hù)，將裝置置于避光、干燥、陰涼處重結(jié)晶[22-24]。結(jié)晶產(chǎn)物濾器濾過(guò)并以氮?dú)獯蹈?。取少量純化野黃芩素進(jìn)行TLC檢測(cè)，雜質(zhì)較多則依上述操作過(guò)程再次重結(jié)晶，雜質(zhì)較少則進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定[25-27]，結(jié)果見(jiàn)圖6。利用野黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品以單點(diǎn)對(duì)照法對(duì)所得純化樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果，重結(jié)晶野黃芩素樣品含量可達(dá)95%以上。

圖6 TLC檢測(cè)結(jié)果Fig.6 TLCdetection results

3 結(jié)論與討論

反應(yīng)條件篩選將總評(píng)“歸一值”概念引入到CCD中，可同時(shí)選用多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化方法較為簡(jiǎn)便、嚴(yán)謹(jǐn)且具有直觀性。作為一種多羥基的黃酮化合物，野黃芩素化學(xué)性質(zhì)極其不穩(wěn)定，易被氧化。試驗(yàn)過(guò)程中當(dāng)溫度大于80℃時(shí)，反應(yīng)后期可明顯觀察到有棕綠色物質(zhì)生成，TLC結(jié)果顯示，雜質(zhì)含量增多，考慮為生成的野黃芩素被氧化后的反應(yīng)副產(chǎn)物。因此，該試驗(yàn)最終確定最優(yōu)工藝條件為固液比15g/L、反應(yīng)溫度80℃。反應(yīng)所得產(chǎn)品經(jīng)重結(jié)晶純化后純度可達(dá)95%及以上。

本試驗(yàn)所采用的野黃芩素制備方法較全合成法及微生物法步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短，可短時(shí)間內(nèi)得到質(zhì)量較好的野黃芩素粗品。低溫重結(jié)晶可使產(chǎn)品純度大幅度提高，但完全析出過(guò)程較為漫長(zhǎng)，低溶解性導(dǎo)致溶劑消耗較大且反復(fù)重結(jié)晶致產(chǎn)品部分損失。