李小沛,張亞玉,趙立春,張春閣,劉繼永
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長(zhǎng)春 130112)
延齡草為百合科延齡草屬植物,全世界約有50種,我國(guó)有3種,即延齡草(Trillium tschonoskii Maxim.)、白花延齡草(T.kamtschaticum Pall.)和西藏延齡草(T.govanianum Wall.)[1-2]。延齡草生于海拔 1 600~3 200 m的林下、山谷陰濕處、山坡或路旁巖石下,主產(chǎn)于我國(guó)西北、東北和西南地區(qū)[3],為珍稀瀕危物種。目前,主要采取遷地保護(hù)、建立自然保護(hù)區(qū)、恢復(fù)和保護(hù)延齡草生長(zhǎng)的生態(tài)環(huán)境、組織培養(yǎng)、遺傳多樣性研究等手段加以保護(hù)[4-8]。
延齡草為國(guó)家醫(yī)藥管理局管理的二類藥材,其化學(xué)成分以皂苷類為主,具有豐富的藥理活性,重樓皂苷為其中一種。重樓皂苷具有抗腫瘤、抗菌、止血、消炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管生成、保護(hù)肝臟與腎臟等功效,廣泛應(yīng)用于各類疾病的治療,是宮血寧、云南白藥等中成藥的主要成分之一[9-10]。目前,有關(guān)白花延齡草中重樓皂苷Ⅶ提取工藝研究相對(duì)較少,本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)白花延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。
Acquity UPLCH-Class(美國(guó)Waters公司);Milli-Q Advantage A10超純水器(美國(guó) Millipore公司);XS205電子天平(瑞士Mettler toledo公司)。
白花延齡草根莖采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省左家白花延齡草馴化栽培實(shí)驗(yàn)田,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所劉繼永研究員鑒定。
重樓皂苷Ⅶ(純度≥98%,農(nóng)業(yè)部特種動(dòng)植物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室);乙腈(色譜純,F(xiàn)isher公司);無水甲醇、正丁醇(分析純,北京化工廠)。
2.1.1 色譜條件 色譜柱:WatersBEHC1(8 2.1mm 50 mm,1.7m);檢測(cè)器:PDA;流速:0.4 mL/min;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;進(jìn)樣量:1L;流動(dòng)相:乙腈-水,線性梯度洗脫(表1)。在此色譜條件下,重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品(A)及白花延齡草樣品(B)HPLC色譜圖見圖1。
表1 流動(dòng)相體積比例Table 1 Mobilephase ratio
圖1 重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品(A)和白花延齡草樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLCchromatogram of polyphyllinⅦstandard(A)and T.kamtschaticum Pall.samples(B)
2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取1.08mg重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品粉末,用甲醇定容于10 mL容量瓶中,配制成0.108 mg/mL的對(duì)照品溶液。
2.1.3 供試品溶液的制備 取白花延齡草根莖適量,于75℃烘箱烘至完全干燥[11],粉碎,過60目篩。精密稱取樣品粉末2 g,共9份,置于250 mL圓底燒瓶中,按照料液比1∶7加入適量甲醇,浸泡過液,70℃回流提取4 h,過濾,將溶液蒸干,加適量水溶解,各加入50 mL水飽和正丁醇[12]萃取3次,合并正丁醇萃取液,回收溶劑蒸干,殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中并定容至刻度,搖勻,0.22m微孔濾膜過濾,備用。
2.1.4 線性關(guān)系 精密吸取對(duì)照品溶液,加甲醇配制成 20.040、10.020、4.536、2.024、1.012g/mL的溶液進(jìn)樣,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=2 877.8X+404.76,R2=0.999 8(n=5),對(duì)應(yīng)的峰面積分別為 57 967、29 572、13 125、6 483、3 174(圖2)。
圖2 重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of polyphyllinⅦ
2.1.5 精密度 按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品,并按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次,分別記錄峰面積,并計(jì)算其峰面積RSD為0.31%,說明儀器精密度良好(表2)。
表2 精密度試驗(yàn)Table 2 Precision experiment
2.1.6 重復(fù)性 精密稱取白花延齡草根莖粉末2.0 g,按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,代入重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程,計(jì)算得到白花延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ的平均含量為 0.337 mg/g,RSD為0.68%。說明該方法重復(fù)性良好(表3)。
表3 重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Repeated experiment
2.1.7 穩(wěn)定性 精密稱取白花延齡草根莖粉末2.0 g,按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件每隔4 h進(jìn)1次樣,結(jié)果顯示,峰面積RSD為0.48%。說明樣品在16 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定(表4)。
表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 4 Stability experiment
2.1.8 加樣回收率 精密稱取9份已知含量的白花延齡草根莖粉末,分別加入重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品溶液適量(濃度為0.108mg/mL),按照“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法,分別制備9份供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算得到白花延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ的平均回收率為98.2%,RSD=0.83%(表5)。
表5 加樣回收率試驗(yàn)Table 5 Recoveries of polyphyllinⅦin samples
對(duì)白花延齡草藥材粉末采用回流法提取[13],選用料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)考察因素,每個(gè)因素選取3個(gè)水平,用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表6)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表7,方差分析結(jié)果見表8。
表6 正交試驗(yàn)因素水平Table 6 Levels and factorsof orthogonal experiment
表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of orthogonal experimental
表8 方差分析結(jié)果Table 8 Analysis of variance
由表7和表8可知,C因素是影響重樓皂苷Ⅶ提取含量的主要因素,即提取溫度。其次是料液比,提取時(shí)間在4h以上對(duì)重樓皂苷Ⅶ含量影響不大。白花延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ的最佳提取工藝條件為A3B1C3。
為驗(yàn)證此最佳工藝條件的穩(wěn)定性,精密稱取白花延齡草根莖粉末2.0g按照料液比1∶9、提取時(shí)間4h、提取溫度90℃,平行制備3份供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,代入重樓皂苷Ⅶ標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程,對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證。計(jì)算得到白花延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ的平均含量為0.930 mg/g,RSD 為 0.91%(表9)。
表9 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 9 Results of validation experiment
目前的研究多采用超聲法提取重樓皂苷,該試驗(yàn)采用回流法進(jìn)行提取,并考慮多種因素,通過正交試驗(yàn)對(duì)白花延齡草重樓皂苷Ⅶ的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取工藝條件為A3B1C3,即料液比1∶9、提取時(shí)間4h、提取溫度90℃。在此工藝條件下,白花延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ的含量為0.931 mg/g。
回流法提取工藝重復(fù)性良好、穩(wěn)定性強(qiáng),可用于各種中草藥中受熱不易遭受破壞的有效成分的提取研究,尤其是皂苷類成分。在最佳提取工藝條件下,進(jìn)行不同加工工藝的研究,更能有效增加各種成分提取率。