馮一鳴，姚德生，盧艷，龍穎，伍光騰，董婷婷，徐勛

0 引言

宮頸鱗癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第二，死亡率居第四位[1]。目前手術(shù)、放療、化療是治療宮頸鱗癌三大手段。大多數(shù)早期宮頸鱗癌患者治療效果較好，而晚期和復(fù)發(fā)的患者治療方案有限并且治療效果較差。因此，尋找一種能夠預(yù)測(cè)其發(fā)生發(fā)展的新型分子標(biāo)志物作為治療的新靶點(diǎn)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。微小RNA（microRNA, 簡(jiǎn)稱miRNA）是一種廣泛分布在人體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用[2]。近年來，有研究表明miRNA可作為惡性腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物[2-6]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：miR-1246在宮頸鱗癌組織與正常宮頸組織中表達(dá)存在差異[7]；miR-1246能促進(jìn)人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，可能是促進(jìn)宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一[8-9]。本研究檢測(cè)宮頸鱗癌患者、鱗狀上皮內(nèi)病變（CIN）患者、健康體檢婦女血清miR-1246的表達(dá)水平并分析其表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系，探討miR-1246作為宮頸鱗癌早期診斷和術(shù)后恢復(fù)及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的血清腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3月—2016年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科住院確診并接受治療的80例宮頸鱗癌患者，30例鱗狀上皮內(nèi)病變（CIN）患者及30例健康體檢婦女為研究對(duì)象。80例宮頸鱗癌患者中，11例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、13例脈管浸潤(rùn)、6例神經(jīng)侵犯、3例切緣陽性、4例宮旁浸潤(rùn)，其中8例復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)組），12例由于術(shù)后去外地診療或不愿配合治療等原因失訪，60例患者在廣泛性全子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后完成隨訪。宮頸鱗癌患者年齡32～74（51±10.68）歲，CIN患者年齡67～33（48±8.46）歲, 健康體檢婦女年齡32～53（46±5.01）歲。

宮頸鱗癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診為宮頸鱗癌，且符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)；（2）能夠耐受廣泛性全子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)者；（3）所有宮頸鱗癌患者治療前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書。

主要試劑：血清總RNA提取試劑盒（miRNeasy Serum/Plasma Kit）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（中國(guó)）合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit:638315）和熒光染料（TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ: RR820A）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象均于清晨采集空腹靜脈血液5 ml，加入促凝管，4℃ 3 000 r/min離心5 min，分離血清，-80℃保存待檢。

1.2.2 血清總RNA的提取及RT-qPCR檢測(cè) 血清提取按照miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒提取總RNA，嚴(yán)格遵循操作步驟及注意事項(xiàng)。從血清中提取總RNA并檢測(cè)了RNA的純度，OD260/OD280:1.8～2.1。cDNA的制備采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取約3.75 μl總RNA，依照寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄酶及產(chǎn)品說明書，按反應(yīng)條件37℃ 1 h，85℃ 5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃條件下保存。行RT-qPCR檢測(cè)， 擴(kuò)增體系為25 μl，其中SYBR熒光染料預(yù)混液（2×）12.5 μl, 無酶水 9.5 μl，cDNA模板2 μl，上下游引物各0.5 μl。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃ 10 s、95℃ 5 s、60℃ 20 s（最后兩步共計(jì)40個(gè)循環(huán)）。以管家基因U6為內(nèi)參，所有樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔，取Ct平均值。

表1 引物序列表Table1 Primer sequence list

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用（x±s）表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，miR-1246的表達(dá)水平與臨床病理特征分析用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以U6為內(nèi)參，ΔCt=CtmiR-1246-CtU6，采用2-ΔΔct法計(jì)算miR-1246的相對(duì)表達(dá)水平。對(duì)檢測(cè)結(jié)果作圖繪制ROC曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）和標(biāo)準(zhǔn)誤，利用AUC評(píng)估m(xù)iR-1246作為腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值。結(jié)果判定AUC≤0.5為無診斷價(jià)值，0.5＜AUC≤0.7為診斷準(zhǔn)確性較低，0.7＜AUC≤0.9為診斷準(zhǔn)確性較好，AUC＞0.9為診斷準(zhǔn)確性最高。

2 結(jié)果

2.1 miR-1246在宮頸鱗癌患者與CIN患者、健康婦女血清標(biāo)本中表達(dá)的比較

宮頸鱗癌組患者血清miR-1246的表達(dá)量（0.322±0.383）與CIN組（0.096±0.130）、健康婦女組（0.038±0.028）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000442, P=0.000013）；三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.83, P=0.000009）；CIN組與健康婦女組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.421），見圖1。結(jié)果表明宮頸鱗癌患者血清中miR-1246的表達(dá)水平明顯高于CIN患者和健康婦女。

圖1 miR-1246在宮頸鱗癌患者組、CIN組和健康婦女組的相對(duì)表達(dá)水平Figure1 Relative expression levels of miR-1246 in cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia(CIN) patients and healthy women

2.2 血清miR-1246的表達(dá)在宮頸鱗癌診斷中的價(jià)值

結(jié)果表明，ROC曲線下面積為0.791（95%CI:0.709～0.872）；當(dāng)截?cái)嘀禐?.517時(shí)，其敏感度為67%，特異性為85%，見圖2。

圖2 血清miR-1246診斷宮頸鱗癌的ROC曲線Figure2 ROC curves of diagnostic value of miR-1246 for cervical cancer

2.3 宮頸鱗癌患者血清miR-1246的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

以宮頸鱗癌患者血清miR-1246的表達(dá)中位數(shù)0.547為界值，分為40例低表達(dá)組（＜0.547）和40例高表達(dá)組（≥0.547）。宮頸鱗癌患者血清miR-1246表達(dá)水平與患者年齡、浸潤(rùn)深度、神經(jīng)侵犯、切緣陽性、宮旁浸潤(rùn)無關(guān)（P＞0.05），但與腫瘤大小、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)密切相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 miR-1246與宮頸鱗癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Table2 Relationship between miR-1246 expression and clinicopathological parameters of cervical cancer patients

2.4 宮頸鱗癌患者術(shù)前與術(shù)后血清miR-1246表達(dá)情況

60例宮頸鱗癌患者術(shù)后1周、術(shù)后1月與術(shù)前血清miR-1246的表達(dá)水平的比值分別為0.60±0.46、0.42±0.28，術(shù)后1月與術(shù)后1周比值為0.33±0.28，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.56,P=0.000000），見圖3。檢測(cè)宮頸鱗癌患者術(shù)后1月和健康婦女血清miR-1246表達(dá)水平，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，宮頸鱗癌患者血清miR-1246含量于術(shù)后逐漸降低，并于術(shù)后1月恢復(fù)到健康婦女水平，見圖4。

2.5 術(shù)后復(fù)發(fā)宮頸鱗癌患者血清miR-1246的表達(dá)

8例復(fù)發(fā)宮頸鱗癌患者miR-1246的相對(duì)表達(dá)水平（1.122±0.355）與健康婦女（0.075±0.027）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.309, P=0.000067）,表明復(fù)發(fā)宮頸鱗癌患者血清miR-1246表達(dá)水平比健康婦女明顯升高，見圖4。

圖3 miR-1246在宮頸鱗癌患者術(shù)前、術(shù)后1周、術(shù)后1月的相對(duì)表達(dá)水平Figure3 Relative expression levels of miR-1246 in cervical squamous cell carcinoma patients before surgery, one week after surgery and one month after surgery

圖4 宮頸鱗癌患者術(shù)后1月、復(fù)發(fā)患者和健康婦女中miR-1246的相對(duì)表達(dá)水平Figure4 Relative expression level of miR-1246 in cervical squamous cell carcinoma patients one month after surgery,recurrent patients and healthy women

3 討論

微小RNA（microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA）是一種小分子非編碼單鏈RNA， miRNA被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密不可分的關(guān)系。近年來，一些學(xué)者已經(jīng)開始研究miRNA與宮頸癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，推測(cè)miRNA可作為宮頸癌早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)的潛在標(biāo)志物。同時(shí)，血清miRNA較穩(wěn)定，能長(zhǎng)期反復(fù)凍融，可作為腫瘤的生物標(biāo)志物，為腫瘤診斷提供一種非損傷性的方法。其中，Sun等[10]采用RT-qPCR方法檢測(cè)血清miR-425-5p的表達(dá)水平，認(rèn)為miR-425-5p可作為宮頸癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。Zhao等[11]探討了治療前血清miRNA-20a水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，認(rèn)為miRNA-20a可作為檢測(cè)宮頸癌早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。hsa-mir-92a也被認(rèn)為與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)，血清hsa-mir-92a水平可作為宮頸癌診斷的獨(dú)立標(biāo)志物[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)血清miRNAs（miR-16-2*， miR-195, miR-2861, miR-497）可作為檢測(cè)宮頸癌的新型非侵入性生物標(biāo)志物[13]。

微小RNA1246（miR-1246）于2008年在人胚胎干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤中呈高表達(dá)，被認(rèn)為可能是一種癌基因。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-1246促進(jìn)肺上皮祖細(xì)胞的快速增殖和未分化表型，在肺癌患者組織中表達(dá)升高，并且發(fā)揮促進(jìn)非小細(xì)胞癌進(jìn)展的作用；另有研究發(fā)現(xiàn)miR-1246在高級(jí)別卵巢漿液性癌中表達(dá)升高[15]。miR-1246也被研究證實(shí)在食管鱗癌中呈高表達(dá)[16]。

本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞水平上，miR-1246對(duì)人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力有促進(jìn)作用，并且下調(diào)miR-1246后可抑制宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的增殖以及侵襲能力，雙向驗(yàn)證認(rèn)為miR-1246可能是促進(jìn)宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一[8,17]。在組織層面上，我們通過RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了宮頸鱗癌患者組織中的miR-1246表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-1246在宮頸鱗癌組織中高表達(dá)[18]。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探討血清miR-1246作為宮頸鱗癌血清腫瘤標(biāo)志物的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-1246在宮頸鱗癌患者血清中的表達(dá)水平明顯升高，通過ROC曲線分析顯示，miR-1246對(duì)于區(qū)分宮頸鱗癌具有良好的特異性和敏感度。在其他的一些腫瘤中，miR-1246大多數(shù)為高表達(dá)，而且也被發(fā)現(xiàn)可作為血清診斷的腫瘤標(biāo)志物。Moshiri等[15]采用數(shù)字PCR方法檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者血漿中miR-1246的表達(dá)，認(rèn)為miR-1246可作為肝細(xì)胞癌潛在的診斷性生物標(biāo)志物；研究發(fā)現(xiàn)miR-1246可作為食管鱗癌新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[16]，另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-1246可作為高級(jí)別漿液性卵巢癌的一種診斷生物標(biāo)志物[19]，與本研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1246的高表達(dá)與FIGO分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)密切相關(guān)。miR-1246高表達(dá)組相對(duì)于低表達(dá)組，腫瘤直徑更大、FIGO分期期別更晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性更多、脈管浸潤(rùn)陽性更多。說明miR-1246也可能作為預(yù)測(cè)宮頸鱗癌患者預(yù)后差異的潛在生物學(xué)指標(biāo)。手術(shù)治療后，血清中miR-1246的表達(dá)水平逐漸降低，一月后表達(dá)水平恢復(fù)正常，說明血清miR-1246表達(dá)水平可監(jiān)測(cè)宮頸鱗癌患者術(shù)后恢復(fù)情況。復(fù)發(fā)患者血清中miR-1246的表達(dá)水平較健康婦女升高，提示宮頸鱗癌患者血清miR-1246的表達(dá)水平可監(jiān)測(cè)患者的復(fù)發(fā)情況。因此，miR-1246可能是宮頸鱗癌早期診斷、術(shù)后恢復(fù)和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的潛在血清腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，血清miR-1246有望成為新的宮頸鱗癌血清腫瘤標(biāo)志物，為宮頸鱗癌的早期診斷和術(shù)后恢復(fù)及監(jiān)測(cè)提供更為便捷有效的檢測(cè)手段。進(jìn)一步深入研究miR-1246在宮頸鱗癌中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制有重要意義。

（致謝：感謝廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤二區(qū)全體醫(yī)護(hù)人員為本課題研究收集血清標(biāo)本提供幫助）