薛亞洲，李虹君，趙家紅，張瑞，李曉慧，龐建智，楊曉峰

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是中老年男性常見的惡性腫瘤，在美國，其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的首位。近年來，隨著老齡化時代的到來、飲食習(xí)慣的改變，我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢，其增長速度甚至超過歐美[1]。治療局限性PCa最有效的外科方式是根治性前列腺切除術(shù)（radical prostatectomy, RP），同期進(jìn)行的盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)（pelvic lymph node dissection, PLND）是診斷PCa有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最準(zhǔn)確的方法[2]。

吲哚菁綠（indocyanine green, ICG）是一種暗青色的近紅外熒光染料，其發(fā)射光在組織中的穿透深度達(dá)1～5 cm，且受生物組織本底的影響較小，可在近紅外區(qū)域呈現(xiàn)熒光，目前常用于血管、視網(wǎng)膜、肝臟腫瘤的診斷和治療[3]。近十余年來逐漸應(yīng)用于熒光引導(dǎo)的手術(shù)操作及臨床研究。有研究報道ICG腫瘤局部注射時，染料外溢影響觀察效果[4-6]。

2015年Jiang等[7]報道了一種通過靜脈注射ICG顯影實體腫瘤的新型注入技術(shù)，該技術(shù)能夠使ICG在實體腫瘤中聚集。其他機(jī)構(gòu)的研究證實ICG在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌及其前哨淋巴結(jié)中也有良好的顯影效果[8-10]。

為此，本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，建立了前列腺癌皮下移植瘤裸鼠模型，通過尾靜脈注射ICG，進(jìn)一步研究靜脈注射ICG體外近紅外熒光成像前列腺癌移植瘤顯像的動態(tài)特征，最佳顯影時間及成像機(jī)制，為臨床應(yīng)用ICG近紅外熒光成像、術(shù)中引導(dǎo)前列腺癌根治提供明確的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株和實驗動物 人前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。SPF級BALB/c-BU雄性裸鼠10只[許可證號：SCXK(蘇)2016-0010]，3～4周齡，體質(zhì)量15～18 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供并給予品系來源證明。實驗動物飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，籠具、墊料、飼料及飲用水均經(jīng)過嚴(yán)格滅菌處理。

1.1.2 設(shè)備 近紅外熒光顯影儀器為多光譜分光融合外科手術(shù)引導(dǎo)系統(tǒng)（multispectral separatemerge guided surgery device，MGS），由太原賽恩思科技發(fā)展有限公司提供，型號SENA1-001，激發(fā)光波長（760±10）nm。

1.1.3 試劑 近紅外熒光染料選用國產(chǎn)注射用吲哚菁綠，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H20045514，25 毫克/支。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

PC3細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（北京賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基（武漢博士德公司）中，0.25%胰蛋白酶消化，傳代。

1.3 建立裸鼠前列腺癌移植瘤模型

對數(shù)生長期的PC3細(xì)胞株消化，1200 r/min離心5 min，以完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×107個，1200 r/min再次離心5 min，棄上清液。在0℃冰上將PC3細(xì)胞重懸浮于200 μl的Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）中。用經(jīng)過預(yù)冷的1 ml注射器抽取細(xì)胞懸液，接種至裸鼠右前肢腋窩皮下，飼養(yǎng)溫度為25℃±1℃。約2周后，移植瘤長至約15 mm×15 mm時進(jìn)行進(jìn)一步實驗研究[11]。

1.4 腫瘤近紅外熒光顯影

10只荷瘤裸鼠，完全隨機(jī)編號1～10號，其中1～7號裸鼠使用2%（體積分?jǐn)?shù)）戊巴比妥鈉（2 ml/kg）腹腔注射麻醉后固定于動物板上。通過尾靜脈將10 mg/kg的ICG注入裸鼠體內(nèi)，多光譜分光融合外科手術(shù)引導(dǎo)系統(tǒng)下進(jìn)行顯影，分別于1 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h在近紅外熒光成像儀下觀察裸鼠腫瘤及全身顯影情況并采集圖片，使用ImageJ軟件（http://rsb.info.nih.gov/ij/，美國國立衛(wèi)生研究院）計算腫瘤及背景圖像的灰度值，選擇合適的感興趣區(qū)域（regions of interest, ROI），計算腫瘤與背景的比率（tumor-to-background ratio, TBR）。

通過以上實驗步驟獲得腫瘤最佳時間，8～10號裸鼠采用相同的實驗方式注射10 mg/kg的ICG。于腫瘤最佳顯影時間點剖取腫瘤組織、肝臟、胃、小腸、大腸、腎臟及瘤旁脂肪組織行離體近紅外熒光成像，計算各臟器及組織的平均灰度值，并比較灰度值大小。

將獲得的腫瘤組織用福爾馬林固定，制成石蠟病理切片，熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織的熒光顯影情況。

2 結(jié)果

1～7號裸鼠經(jīng)尾靜脈注射ICG后，肝臟、甲狀腺以及眼睛部位于注射后即刻顯影。隨著時間的推移，腫瘤部位熒光逐漸增強(qiáng)，瘤周背景熒光相對減弱，12 h起獲得良好的TBR，此時腫瘤顯影效果最佳，并延續(xù)至24 h，48 h腫瘤及背景熒光均明顯減弱，72 h腫瘤及瘤周背景熒光完全消失，見圖1～2。

圖1 裸鼠腫瘤及背景熒光強(qiáng)度和腫瘤背景比值隨時間推移的變化情況Figure1 Changes of tumor and background fluorescence intensity and tumor background ratio over time in nude mice

圖2 注射ICG 24h后裸鼠的全身顯影效果圖Figure2 Whole-body development effect of nude mice after ICG injection for 24 h

由以上結(jié)果知12～24 h為腫瘤最佳顯影時間區(qū)間，將8～10號裸鼠于24 h進(jìn)行解剖，觀察到肝臟、胃、大腸、小腸、腎臟、腫瘤顯影，瘤周脂肪組織未見明顯顯影，見圖3。計算各組織及器官的平均灰度值：腫瘤為69.93、肝臟為80.16、胃為210.18、小腸為105.89、大腸為166.23、腎臟為57.91、瘤周脂肪為21.43?？芍@影效果：胃＞大腸＞小腸＞肝臟＞腫瘤＞腎臟＞瘤周脂肪組織。

熒光顯微鏡觀察腫瘤組織的病理切片，可見明顯綠色熒光信號，見圖4，為ICG染料本身的顏色，從而說明ICG積聚于腫瘤組織中。

3 討論

圖3 注射ICG 24h后裸鼠腫瘤組織、各臟器及周圍脂肪組織顯影效果Figure3 Imaging effect of tumor tissue, organs and surrounding adipose tissue in nude mice after injection of ICG for 24 h

圖4 PC3移植瘤病理(A)和熒光顯微鏡下(B) 檢查結(jié)果 (×200)Figure4 Pathological(A) and fluorescence microscopy(B)results of PC3 xenograft tumor (×200)

RP是治療局限性前列腺癌最常用的臨床手段，完整的切除腫瘤及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)對于PCa患者的預(yù)后至關(guān)重要[12]。目前關(guān)于PCa及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測手段主要有4種方式：常規(guī)的斷層掃描CT、MRI、腫瘤功能性成像膽堿PET/CT以及前列腺癌特異性成像前列腺特異性膜抗原（The prostate-specific membrane antigen, PSMA）PET/CT。最新的PSMA PET/CT可以將前列腺盆腔淋巴結(jié)檢出率提升至66%，但仍然有1/3的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被漏診[13]。并且以上4種影像學(xué)檢查只能用于術(shù)前評估，無法實時指導(dǎo)手術(shù)操作，導(dǎo)致前列腺癌手術(shù)仍然難以避免陽性切緣及陽性淋巴結(jié)的遺漏。

光學(xué)分子成像技術(shù)的發(fā)展為解決以上問題提供了新的思路。光學(xué)分子成像是一種采用光學(xué)儀器和設(shè)備在活體狀態(tài)下從微觀上顯示組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的影像技術(shù)，具有實時、無創(chuàng)、精準(zhǔn)及敏感等特點，可在細(xì)胞和分子水平進(jìn)行腫瘤早期篩查和診斷[14]。其原理為采用熒光報告集團(tuán)或熒光染料標(biāo)記的目的細(xì)胞，通過敏感的光學(xué)成像儀器，檢測活體生物體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)行為[15]。目前有多種光學(xué)成像方式可以在術(shù)中使用，例如可見光、紫外線和紅外線。與可見光相比，近紅外光具有組織穿透深度大、背景吸收散射度低、自發(fā)熒光少、信噪比高等優(yōu)點[16]。ICG作為目前最常用的一種近紅外熒光染料，已經(jīng)被用于諸多腫瘤以及前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node, SLN）的檢測。2008年Kusano等[17]進(jìn)行了胃腸道惡性腫瘤ICG熒光成像引導(dǎo)的SLN可行性研究。該研究小組在術(shù)中為胃癌及直腸癌患者腫瘤周圍注射一定濃度的ICG，其中胃癌患者SLN的檢出率為90.9%，直腸癌患者的檢出率為88.5%，證明了ICG用于胃腸道SLN顯影的可行性。2010年Hojo等[18]對142例乳腺癌患者使用ICG標(biāo)記SLN，檢出結(jié)果為99.3%（140/142），平均檢出數(shù)量約為3.8個，證實ICG在乳腺癌的淋巴結(jié)清掃術(shù)中發(fā)揮著重要的臨床意義。2018年查小應(yīng)等[19]將ICG溶液注射至甲狀腺癌患者的腫瘤周圍，通過熒光示蹤標(biāo)記法對甲狀腺癌患者進(jìn)行SLN活檢，檢出率高于70%，且陰性率低于20%，局部注射ICG用于甲狀腺癌SLN活檢具有重要的臨床參考價值。為了探求ICG在前列腺癌手術(shù)中的使用效果，多家國外機(jī)構(gòu)試圖在前列腺內(nèi)注射ICG，以期望觀察到前列腺腫瘤及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)[4-6]。然而，與胃腸道手術(shù)相比，前列腺體積較小且質(zhì)韌。此外，由于骨盆的限制，RP手術(shù)操作空間常常受限。以上原因?qū)е铝司植孔⑸銲CG的難度較大，容易出現(xiàn)腫瘤周圍的ICG染料溢出，使血管及臨近組織均產(chǎn)生了不同程度的與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)同等的高背景干擾信號。此外，前列腺淋巴系統(tǒng)的引流模式非常復(fù)雜，并顯示出不同的途徑，進(jìn)一步阻礙了在前列腺內(nèi)注射ICG的使用[4,20]。

1986年Matsumura等[21]將伊文思藍(lán)溶液通過尾靜脈注射至荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察到伊文思藍(lán)-血漿蛋白大分子結(jié)合物具有明顯的腫瘤蓄積作用以及很強(qiáng)的滯留性，并提出了實體腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)，簡稱EPR（enhanced permeability and retention effect）效應(yīng)。EPR效應(yīng)是指當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖、聚集直徑達(dá)2～3 mm時，自發(fā)誘導(dǎo)形成新生血管系統(tǒng)，其血管形狀不規(guī)則，血管擴(kuò)張；內(nèi)皮細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞間隙大。同時，腫瘤組織中淋巴回流受阻。這些特殊結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致分子量大于40 kDa的大分子藥物和膠粒載體廣泛滲入腫瘤組織，蓄積并長時間滯留[22]。2015年Jiang等[7]將ICG溶液以5 mg/kg的劑量通過尾靜脈注射至荷瘤裸鼠體內(nèi)，證實了腫瘤對ICG染料的EPR效應(yīng)。

在此基礎(chǔ)上，Zeh等[8]通過建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤的荷瘤裸鼠模型，將5 mg/kg ICG通過尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，腫瘤于6～48 h產(chǎn)生了一個弱于1 h但是持續(xù)時間長并穩(wěn)定的顯影效果。并將這段較長時間的穩(wěn)定顯影平臺期稱之為ICG的“第二時間窗口”。隨后該研究組在10名膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者身上進(jìn)行了臨床試驗，患者于術(shù)前1天注射5 mg/kg的ICG試劑，手術(shù)時通過近紅外儀器顯示：所有患者均出現(xiàn)了腫瘤的顯影，并顯現(xiàn)出明顯的腫瘤邊界。摘除瘤體后行病理檢查，證實腫瘤邊緣的可靠性，并得出結(jié)論：術(shù)前24 h靜脈注射ICG，能夠達(dá)到良好的手術(shù)顯影效果。隨后，Xia等[20]將此技術(shù)應(yīng)用于4名前列腺癌患者，對其行機(jī)器人輔助下的RP手術(shù)，并行擴(kuò)大的PLND。在近紅外儀器的輔助下，術(shù)者完整地摘除了前列腺及腫瘤組織，并從3例患者中獲得了額外顯影的淋巴結(jié)，經(jīng)病理證實為前列腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，從而得出結(jié)論：該技術(shù)在前列腺癌患者身上具有可行性。

本實驗通過建立前列腺癌荷瘤裸鼠皮下移植瘤模型著重研究了隨著時間的變化ICG在前列腺腫瘤及全身代謝的情況。通過尾靜脈將ICG試劑注射至前列腺癌皮下移植瘤體內(nèi)，于12～24 h獲得了最佳的腫瘤顯影效果，此時腫瘤背景比率最高，為1.40～1.47，并且肉眼可見明確的腫瘤及背景組織分界。這與上文提到的ICG“第二時間窗口”技術(shù)有時間上的重疊。但是，本項目組通過實驗并沒有于1 h左右觀察到明顯的腫瘤顯影，由于自體熒光的存在，甚至在3 h之前，瘤周的背景熒光強(qiáng)度會略強(qiáng)于腫瘤本身。我們認(rèn)為此現(xiàn)象與ICG濃聚于前列腺癌腫瘤部位需要一定時間有關(guān)，故靜脈注射ICG用于前列腺癌荷瘤裸鼠模型，其顯影效果并不完全與Zeh等[8]的“第二時間窗口”理論相吻合。

同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，由于ICG經(jīng)肝膽代謝進(jìn)入腸道等消化器官，故ICG除濃聚于腫瘤部位，直腸部位也有明顯的熒光信號。在24 h解剖可知，此時直腸部位的熒光強(qiáng)度甚至?xí)哂谀[瘤本身，由于前列腺與直腸在解剖關(guān)系上毗鄰，這種現(xiàn)象有可能導(dǎo)致前列腺部位的熒光與直腸部位的熒光重疊，影響RP手術(shù)中熒光導(dǎo)航的圖像效果，但是，由于目前ICG用于臨床RP手術(shù)的案例較少，具體的影響程度仍有待進(jìn)一步的研究和臨床驗證。

另外，ICG靜脈注射后12～24 h移植瘤成像效果最佳，與腫瘤組織血管的EPR效應(yīng)有關(guān)。但是，由于單純注射ICG缺乏靶向特異性，其成像效果還有待進(jìn)一步提高。目前有研究小組將ICG與前列腺特異性膜抗原（PSMA）抗體J591相結(jié)合，制造出具有前列腺癌靶向作用的單克隆抗體-熒光團(tuán)綴合物：J591-ICG。在前列腺癌皮下移植瘤的裸鼠模型中，獲得了良好的腫瘤顯影效果[23]。但是該試劑仍然處于動物實驗階段，其藥物安全性仍需要進(jìn)一步的人體試驗驗證，且復(fù)雜的合成機(jī)制及昂貴的單克隆抗體價格限制了此試劑的臨床應(yīng)用。盡管如此，ICG與特異性抗體相結(jié)合仍然是未來腫瘤顯影的發(fā)展方向。

綜上，ICG經(jīng)靜脈注射后可以被前列腺癌腫瘤吸收，并產(chǎn)生良好的腫瘤熒光顯影的效果。腫瘤的最佳顯影時間是12～24 h，未來臨床應(yīng)用時，只需要于術(shù)前晚給患者注射ICG，即可于手術(shù)時獲得良好的顯影效果，此方式簡單實用且安全性佳，將具有廣闊的應(yīng)用前景。