林中民， 陳國(guó)榮， 張泉波， 王 芳， 項(xiàng)蘭婷， 曹瓊潔( . 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 省部共建眼視光學(xué)和

視覺科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者的主要心血管并發(fā)癥之一[1]，臨床上主要依靠控制血糖、降血壓來控制糖尿病心肌病病程，作用有限。近年來越來越多的證據(jù)顯示炎癥可能單獨(dú)或作為高血糖的下游環(huán)節(jié)在糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[2, 3]。MD2是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4 , TLR4)的輔助蛋白，是LPS-TLR4炎癥反應(yīng)的直接介導(dǎo)物。TLR4/MD2-LPS形成三元復(fù)合物激活下游信號(hào)通路：MAPKs/NF-κB炎癥因子轉(zhuǎn)錄途徑和干擾素-β(IFN-β)轉(zhuǎn)錄途徑[4]，調(diào)控下游炎癥因子、趨化因子和黏附分子等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[5]。MD2還可以結(jié)合其他內(nèi)源性配體，如HMGB1[6]，SAA3[7]和膽固醇[8]，以激活TLR4促炎信號(hào)通路，在多種慢性炎癥疾病發(fā)生發(fā)展過程中也起重要作用，如糖尿病并發(fā)癥、肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化等[9-11]。MD2在心肌炎癥反應(yīng)中的作用未見報(bào)道，但慢性炎癥作為應(yīng)答組織或胞內(nèi)應(yīng)激損傷的常見病理反應(yīng)，在不同器官或組織的免疫防御機(jī)制是相通的。今后，阻斷炎癥反應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)，如靶向基因沉默等方法有望成為DCM治療或聯(lián)合治療的重要策略。所以我們提出假設(shè)MD2基因沉默能干擾高糖/高血糖誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)，對(duì)DCM發(fā)生發(fā)展起重要作用。

本課題旨在體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系H9C2來明確高糖對(duì)細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步研究MD2基因沉默對(duì)高糖處理后的大鼠心肌細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子水平的影響，并初步探討其可能機(jī)制，或能為治療糖尿病心肌病提供新的思考和方案。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大鼠心肌細(xì)胞系H9C2購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、0.05% Trypsin-EDTA、Lipo-fectamineTMRNAi MAX 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑、power upTMSYBR green master mix均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；D-葡萄糖和D-甘露醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；siRNA由中國(guó)廣州銳博生物科技有限公司合成；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS法)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；一抗抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technolgy公司；硝酸纖維素膜購(gòu)于德國(guó)GE healthcare公司；Cycletest Plus DNA Reagent試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司；7500型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司；Axiovert 200倒置相差熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞接近80% 融合時(shí)用0.05% 胰蛋白酶消化傳代。倒置相差熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞及圖像記錄。

1.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2接種于多孔培養(yǎng)板，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將終濃度為50 nmol/L的MD2基因小干擾RNA(si-MD2)按組別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，以相同方法轉(zhuǎn)染一段長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)都與siRNA類似的隨機(jī)序列寡核苷酸雙鏈作為陰性對(duì)照(negative control，NC)。具體轉(zhuǎn)染步驟根據(jù)LipofectamineTMRNAi MAX 轉(zhuǎn)染說明書。si-MD2序列：5’-CCAATGGATTTGTGCATGTTT-3’ 和5’-ACATGCAC AAATCCATTGGTT-3’。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)共分為4組，LG組： 33 mmol/L甘露醇；HG組： 33 mmol/L D-葡萄糖；HG + NC組： 50 nmol/L NC + 33 mmol/L D-葡萄糖；HG + si-MD2組： 50 nmol/L si-MD2 + 33 mmol/L D-葡萄糖。H9C2細(xì)胞按1.3方法轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖刺激48 h，對(duì)照組加入33 mmol/L的 D-甘露醇用于排除滲透壓作用干擾。

1.5 細(xì)胞 RNA提取及RT-qPCR

Trizol試劑法分別提取4組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)各細(xì)胞中MD2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素6(interleukin 6, IL-6) 的mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為: ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參, ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組, 相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。內(nèi)參GAPDH的上游引物為5' TATGACTCTACCCACGGCAAG 3'，下游引物為5' ATACTCAGCACCAGCATCACC 3'；MD2的上游引物為5' TATTTACTGAATCTGAGAGGC 3'，下游引物為5' GAATGAACTCAACATGCAC 3'； TNF-α的上游引物為5' TACTCCCAGGTTCTCTTCAAGG 3'，下游引物為5' CTCCAGCTGCTCCTCCGCTTG 3'；IL-1β的上游引物為5' CACCTCTCAAGCAGAGCACAG 3'，下游引物為5' GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC 3'；IL-6的上游引物為5' TGGAGTTCCGTTTCTACCTG 3'，下游引物為5' CTTAGCCACTCCTTCTGTGA 3'。RT-PCR 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為20 μl。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞以3×103cells/well均勻接種到96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按上述方法處理細(xì)胞48 h后，棄去培養(yǎng)基，于每孔中加入85 μl無血清F12培養(yǎng)液和15 μl MTS混合液，于37℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(A)，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞數(shù)目= 實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡

將上述4個(gè)組別的細(xì)胞用0.05% 胰蛋白酶消化并收集，按Cycletest Plus DNA Reagent試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況及細(xì)胞凋亡水平，右上與右下兩個(gè)象限百分率之和即是細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

將上述4個(gè)組別的細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，提取各組細(xì)胞的總蛋白。蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5% 脫脂奶粉-PBST封閉液封閉3 h后，按1∶1 000稀釋一抗抗體，于 4℃孵育過夜，經(jīng)PBS洗脫后再用1∶5 000的帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，最后在Odyssey Licor雙色紅外激光成像儀上進(jìn)行曝光成像，然后通過image pro plus軟件計(jì)算灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MD2水平的變化

為了研究MD2基因沉默對(duì)高糖處理后的心肌細(xì)胞的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了MD2的siRNA用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以求達(dá)到基因沉默的目的。結(jié)果如圖1和表1所示，轉(zhuǎn)染si-MD2后，細(xì)胞中MD2 mRNA和蛋白水平均顯著下降(P<0.01)，說明通過小 RNA 干擾技術(shù)達(dá)到MD2 基因沉默的效果。

Fig.1The protein expression levels of MD2 in the H9C2 cells tested by Western blot

Mock： Blank control; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

GroupmRNA levelProtein levelMock1.01±0.010.59±0.03 NC0.97±0.110.50±0.03 si-MD20.32±0.04**0.08±0.01**

Mock： Blank control; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

**P<0.01vsNC group

2.2 MD2基因沉默對(duì)高糖處理后炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測(cè)4組H9C2細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平。HG 組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA相對(duì)水平與LG組相比顯著升高(P<0.01)；相較HG + NC組，HG + si-MD2組的TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)水平顯著下調(diào)(P< 0.05，表2)。

GroupTNF-αIL-1βIL-6LG1.04±0.031.05±0.061.02±0.02HG2.38±0.48**3.56±0.45**2.19±0.10**HG + NC2.88±0.844.05±0.292.36±0.22HG + si-MD21.20±0.06#1.48±0.13##1.32±0.09##

TNF-α： Tumor necrosis factor alpha； IL-1β： Interleukin 1β； IL-6： Interleukin 6

**P<0.01vsLG group;#P<0.05,##P<0.01vsHG + NC group

2.3 MD2基因沉默對(duì)高糖處理后的心肌細(xì)胞增殖能力的影響

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HG組的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目為(85.19±0.65)%，與LG組(100%)相比明顯減少 (P<0.01)；而HG + si-MD2組的相對(duì)細(xì)胞數(shù)目為 (94.73±1.22) %，顯著高于HG + NC組的(80.89±0.74)% (P<0.01)。結(jié)合顯微鏡對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的圖像記錄(圖2)可以看出，高糖處理抑制心肌細(xì)胞的增殖，而MD2基因沉默可以促進(jìn)高糖處理后的心肌細(xì)胞增殖。

Fig.2The effects ofMD2 gene silencing on the proliferation of H9C2 cells treated with high glucose. Photographs of cells following transfection 48 h were taken by optical microscope (uncolored ×200)

LG: Low glucose; HG: High glucose; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

2.4 MD2基因沉默對(duì)高糖處理后的心肌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，HG組細(xì)胞滯留在G0/G1的細(xì)胞數(shù)(54.96±0.37)% 較LG組(41.73± 0.61)% 明顯增多，而S期細(xì)胞從LG組的(46.57± 0.94)% 減少到(31.60±1.13)% (P<0.01)。MD2基因沉默后，HG + si-MD2組滯留在G0/G1的細(xì)胞數(shù)為 (45.14±1.59) %，顯著少于HG + NC組的(54.42±1.31)% (P<0.01)，而S期細(xì)胞從HG + NC組的(32.44±1.07)% 增多到(39.71±1.12)% (P<0.01，圖3)。

Fig.3The effects ofMD2 gene silencing on the cell cycle of H9C2 cells treated with high glucose. The most representative results in three independent experiments are depicted

LG: Low glucose; HG: High glucose; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

2.5 MD2基因沉默對(duì)高糖處理后的心肌細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)HG 組的細(xì)胞凋亡率為(8.30±0.25)%，顯著高于LG組的(3.86±0.36)% (P<0.01)；與HG + NC組的(7.65±1.04)% 相比，HG + si-MD2組的細(xì)胞凋亡率為(5.78±0.22)%，顯著下降(P<0.01，圖4)。結(jié)果說明高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而MD2基因沉默可以減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

Fig.4The effects ofMD2 gene silencing on the apoptotic rate of H9C2 cells treated with high glucose. The most representative results in three independent experiments are depicted

LG:Low glucose; HG: High glucose; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

2.6 MD2基因沉默對(duì)高糖處理后心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖處理的心肌細(xì)胞中凋亡信號(hào)分子Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.119±0.004)，較低糖組的(0.05±0.007)顯著升高(P<0.01) ；與HG + NC組的(0.141± 0.006)相比，HG + si-MD2組的Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為 (0.096±0.006)，顯著下降(P< 0.01，圖5)。

2.7 MD2基因沉默對(duì)高糖處理后的ERK1/2、P38 MAPK、JNK蛋白磷酸化水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與LG組相比，HG組細(xì)胞中ERK1/2、P38 MAPK、JNK蛋白的磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；而HG + si-MD2組細(xì)胞中ERK1/2、P38 MAPK、JNK蛋白的磷酸化水平與HG + NC組相比明顯下降(P<0.01，圖6，表3)。說明MD2基因沉默可以抑制高糖誘導(dǎo)的ERK1/2、P38 MAPK、JNK蛋白磷酸化。

Fig.5The effects ofMD2 gene silencing on Cleaved Caspase-3 protein expression level of H9C2 cells treated with high glucose

LG:Low glucose; HG: High glucose; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

Fig.6The effects ofMD2 gene silencing on phosphorylation of ERK1/2, P38 MAPK and JNK protein of high glucose-induced H9C2 cells

LG:Low glucose; HG: High glucose; NC: Negative control; si-MD2: MD2 siRNA

Groupp-ERK1/2/ERK1/2p-P38 /P38p-JNK/JNKLG0.31±0.020.66±0.020.19±0.01HG0.96±0.04**0.93±0.03**1.05±0.03**HG + NC1.03±0.010.93±0.020.88±0.06HG + si-MD20.55±0.02##0.61±0.03##0.20±0.01##

**P<0.01vsLG group;##P<0.01vsHG + NC group

3 討論

糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，獨(dú)立于高血壓病、冠狀動(dòng)脈疾病和其它已知重大心臟瓣膜疾病[12]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥反應(yīng)以炎癥標(biāo)志物升高為特征，成為糖尿病心肌病的重要病理因素之一[13]。高糖能激活組織或胞內(nèi)的損傷應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中炎癥因子、趨化因子和黏附分子的分泌增加[14]。因此阻斷炎癥反應(yīng)及其相關(guān)靶點(diǎn)有望成為今后DCM 治療的重要策略。已有研究顯示漢黃芩素在STZ糖尿病小鼠中表現(xiàn)出抗炎和抗氧化應(yīng)激的特性，可以通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激來減輕高血糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[15]。Pan等人的研究發(fā)現(xiàn)抗炎化合物姜黃素[5]可以通過抑制NF-κB激活、減少炎癥因子的產(chǎn)生而作為糖尿病心肌病的潛在治療劑。

TNF-α、IL-1β、IL-6-是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要炎癥因子，能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，引起細(xì)胞異常增殖、分化及合成多種炎癥因子等一系列生理生化改變。本研究證實(shí)高糖處理48 h的H9C2細(xì)胞內(nèi)上述炎癥因子表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞增殖能力下降。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，高糖處理導(dǎo)致H9C2細(xì)胞滯留在G0/G1期，這可能是H9C2細(xì)胞增殖受到抑制的原因之一。而MD2基因沉默顯著抑制高糖刺激的 H9C2 細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)，明顯減少滯留在G0/G1期的細(xì)胞，促進(jìn)高糖處理后的心肌細(xì)胞增殖。已有報(bào)道MD2小分子抑制劑可以阻斷MD2與TLR4的結(jié)合，顯著減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)[16]。Wang等人的工作發(fā)現(xiàn)飽和棕櫚酸能通過直接結(jié)合TLR4輔助蛋白MD2誘導(dǎo)心肌炎性損傷[17]。此外，F(xiàn)ang等人的最新研究表明MD2通過激活炎癥途徑中的JNK / ERK和NF-κB炎癥通路，在肥胖誘導(dǎo)的心臟肥大發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。我們推測(cè)MD2表達(dá)下調(diào)可抑制炎癥信號(hào)通路，減輕高糖所致的心肌細(xì)胞炎癥損傷，使細(xì)胞活性得到明顯提高，從而促進(jìn)高糖處理后的心肌細(xì)胞增殖。

無論在糖尿病患者和糖尿病動(dòng)物模型中，心肌細(xì)胞凋亡都是持續(xù)高血糖的關(guān)鍵病理結(jié)果[19]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體自身進(jìn)行的一種程序性死亡，在多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中都伴有心肌細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)MD2基因沉默可以減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，顯著降低細(xì)胞中Caspase-3 活化水平?？赡躆D2基因沉默通過抑制Caspase-3的活性，從而抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

絲裂原活化蛋白激酶 MAPK信號(hào)通路是涉及了多級(jí)蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與了糖尿病心肌病最重要的細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的病理過程[21-23]。其家族成員ERK1/2[24, 25]， JNK[25]和p38 MAPK[26]能夠被多種胞外刺激激活，將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，調(diào)控著細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和炎癥等多種生物學(xué)反應(yīng)。所以我們通過Western blot檢測(cè)ERK1/2、P38 MAPK、JNK蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示MD2基因沉默可以抑制高糖誘導(dǎo)的ERK1/2、P38 MAPK、JNK蛋白激活。

綜上所述，MD2基因沉默可能通過抑制ERK、P38 MAPK和JNK信號(hào)通路的激活來減少高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究首次探索了MD2基因沉默對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷、炎癥發(fā)生過程的影響及作用機(jī)制，或能為有效預(yù)防和治療糖尿病心肌病提供新的思考和方案。